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微小RNA(microRNA)以及RNA结合蛋白对参与心肌重构重要基因调节作用的研究

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论文一

前言

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

讨论

结论

论文二

前言

材料和方法

实验结果

讨论

结论

论文三

前言

一、实验材料

二、实验方法

实验结果

讨论

结论

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参考文献

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摘要

实验目的
　　 体内自然存在的微小RNA(miRNA)是小的转录后调节的非编码RNA,它能够通过影响翻译或者靶。mRNA稳定性从而调节基因表达。miRNA参与多种基本生物学过程,如细胞增殖、发育、分化、凋亡、病毒感染和癌症等。在生命活动中发挥了重要调控作用。将是继siRNA之后新的研究热点之一。超过三分之一的人类基因都受miRNA的控制。
　　 由于miRNA天然存在于动植物体内,探索miRNA对肿瘤抑制基因和疾病相关基因的作用无疑将会揭开这些疾病治疗的新篇章。目前只有少数miRNA的部分功能和靶点被鉴定。组织金属蛋白酶抑制因子3基因和miR-1,miR-21(microRNA-21)均在心血管紊乱疾病和癌症中异常表达。miR-1广泛分布于心肌,骨骼肌。TIMP3(组织金属蛋白酶抑制因子3基因)在心脏中大量存在,在缺陷的心脏中表达下调。冠状动脉硬化的个体内miR-1过度表达。在正常或心肌梗塞的大鼠心脏里过表达miR-1会加速心律不齐。用反义的抑制剂除去心肌梗塞大鼠心脏内过表达的miR-1会减轻这种症状。miR-1表达低于正常水平可引起心肌肥大。miRNAs的失调成为心脏病的起因之一。未来的任务是确认这些失调miRNA的靶mRNA因为miRNA通常有许多个靶mRNAs,每个miRNA对心肌生长和功能的作用反映了许多mRNA表达的改变。进一步分析这些miRNA的靶mRNA会为心血管疾病提供新的诊断,预后和治疗靶标。
　　 心力衰竭高发病率、患病率和死亡率已经成为21世纪发达和发展中国家的重要公共卫生问题。目前的心衰治疗方案均有一定的副作用,因此继续研究疾病的基本病因以便选择特异性的对因治疗方案和靶点具有特殊的重要性和迫切性。几个不同的研究小组发现miR-21在心肌肥厚模型中表达持续增高。而且用反义核苷酸敲减miR-21的表达可以抑制心肌细胞肥大的表型。miRNA-21在心力衰竭模型鼠的成纤维细胞内大大增加。很重要的是,心力衰竭患者心肌亦有同样结果。心肌重构在心衰进展中起重要作用,目前尚未有人证明miR-21在心肌细胞内调节参与心肌重构通路基因的表达。正常情况下,MMPs(基质金属蛋白酶)和TIMPs(组织金属蛋白酶抑制剂)之间处于平衡状态。MMPs和TIMPs的失衡与心室扩张和重构有关,并将最终导致心力衰竭。终末期心衰患者心室肌中TIMP-3减少程度与心室基质重构程度平行。据文献报道MMPs和ADAMs(分离整和素金属蛋白酶)的有力抑制剂TIMP-3将会是一个很有希望的治疗靶点。近年来的研究已经明确导致心衰发生发展的基本机制是心肌重构,慢性心力衰竭治疗的关键还是逆转或者延缓心肌重构。心肌成纤维细胞分泌的MMPs/TIMPs(组织基质金属蛋白酶/组织基质金属蛋白酶抑制剂)的平衡在心室重构中起着十分重要的作用,因而成为心力衰竭治疗的一个新靶标。临床上已经开始应用多种药物增加组织金属蛋白酶抑制因子3基因表达减少MMPs水平来改善心室重构。基于这些研究基础,本课题以在心力衰竭中异常表达的miR-21为靶点的反义核苷酸(antagomiR-21)对心肌成纤维细胞表达的TIMP3/MMPs进行调控,从而达到改善心肌重构,避免心脏纤维化,治疗心力衰竭的目的。本项目证明miR-21参与调控心肌重构重要基因,miR-21调控组织金属蛋白酶抑制因子3基因,MMP9在心肌细胞内未见相关报道。从而根据调控通路推断miR-21反义核苷酸同时可以抑制MMPs等参与心肌重构的重要基因在心力衰竭中的异常表达。进而可能抑制心力衰竭。
　　 真核生物mRNA 3’非翻译区可以调节转录本的稳定性、亚细胞定位和翻译水平,决定某一特定mRNA的命运,是许多基因表达所必需的一个调节区。3’非翻译区介导的功能的修饰可影响一个或多个基因的表达,从而导致疾病的发生。对相关mRNA 3’非翻译区的调节序列和与这些序列特异结合的蛋白质等具体信息的认识,将成为药物设计的新的分子靶。
　　 实验结果
　　 1、Targetscan,pictar等生物信息学工具预测表明,hsa-miR-1,hsa-miR-20a,hsa-miR-106b,hsa-miR-30e-5p,hsa-miR-206,hsa-miR-144,hsa-miR-181,hsa-miR-30d,hsa-miR-221,hsa-miR-21,hsa-miR-30b,hsa-miR-101,hsa-miR-22等均可能以组织金属蛋白酶抑制因子3基因为靶基因,其中miR-1最为可能,因为它被许多miRNA预测程序列为前三个最有可能以组织金属蛋白酶抑制因子3基因为靶基因的miRNA。
　　 2、Western blot证实has-miR-1(人microR-NA-1)下调组织金属蛋白酶抑制因子3基因蛋白表达水平。
　　 3、实时荧光定量PCR证明相对于阴性转染对照组,hsa-miR-1下调组织金属蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平。
　　 4、应用生物信息学技术预测hsa-miR-1在组织金属蛋白酶抑制因子3基因基因中的靶点,PCR技术扩增niR-1预测靶点附近组织金属蛋白酶抑制因子3基因,克隆入荧光素酶表达载体pGL3构建重组质粒pGL3-TIMP3,并用定点突变技术成功构建突变载体,电泳鉴定重组质粒表达及测序验证；
　　 5、hsa-miK-1野生型与突变型载体与renilla和hsa-miR-1共转染粒转染293细胞,双荧光素酶实验证实了hsa-miR-1在组织金属蛋白酶抑制因子3基因内的第一个预测靶点为ACATTCCA。hsa-miR-1对组织金属蛋白酶抑制因子3基因的调控是直接的。从而确定了参与组织金属蛋白酶抑制因子3基因的顺式调控序列。用克隆,定点突变和双亮荧光酶测定技术证实了hsa-miR-1直接打靶组织金属蛋白酶抑制因子3基因基因,在组织金属蛋白酶抑制因子3基因3’非翻译区内存在靶点。对于hsa-miR-1在组织金属蛋白酶抑制因子3基因内的第一个预测靶点,突变型载体的荧光强度以海。肾荧光素酶的荧光强度作内参优化后,明显高于野生型。T-test统计分析具有显著性p<0.001。而miRNA前体阴性对照转染组野生型和突变型的荧光素酶的活力以海参荧光素酶作内参优化后则呈不规则变化。对于miR-1在组织金属蛋白酶抑制因子3基因内的第二个预测靶点,在突变四个碱基的情况下,这种变化不明显,无统计学意义。
　　 6、通过转染和实时荧光定量PCR实验证实了miR-21可以下调组织金属蛋白酶抑制因子3基因,增加MMP9的表达,同时证明了antagomiR-21可以增加TIMP3降低MMP9的表达。TIMP3在心肌肥大和心力衰竭中表达降低,而miR-21在这些心血管疾病中异常升高。TIMP3和MMP9是参与心肌重构的重要分子。而心力衰竭的基础就是心肌重构。实验结果提示了通过抑制miR-21在心肌肥大和心力衰竭中的异常表达,有望调控心肌重构途径。通过此试验证明了TIMP3受另外一个反式作用因子miR-21的调节。
　　 7、通过IP和-RT-PCR实验证实HuR蛋白质结合组织金属蛋白酶抑制因子3基因3’未翻译区,通过siRNA knock down HuR从而下调组织金属蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平证实HuR参与组织金属蛋白酶抑制因子3基因的转录后调节。其可能结合的区域由生物信息学方法预测。通过此试验证明了组织金属蛋白酶抑制因子3基因的另外一个反式作用因子:ARE结合蛋白HuR。
　　 结 论
　　 实验证明了在HEK293细胞内hsa-miR-1直接调控肿瘤抑制基因组织金属蛋白酶抑制因子3基因的转录后调节。下调其mRNA和蛋白质表达水平。在组织金属蛋白酶抑制因子3基因3’未翻译区内存在组织金属蛋白酶抑制因子3基因的靶点。hsa-miR-1通过组织金属蛋白酶抑制因子3基因3’UTR调节的顺式作用元件得以确定。通过IP和RT-PCR实验证实ARE结合蛋白HuR结合组织金属蛋白酶抑制因子3基因3’未翻译区,通过siRNA敲减HuR基因表达从而下调组织金属蛋白酶抑制因子3基因mRNA水平证实HuR参与组织金属蛋白酶抑制因子3基因的转录后调节。从而确定了HuR为参与组织金属蛋白酶抑制因子3基因转录后调节的反式作用元件。通过转染和实时荧光定量PCR实验证实了miR-21可以下调组织金属蛋白酶抑制因子3基因,增加MMP9的表达,同时证明了antagomiR-21可以增加组织金属蛋白酶抑制因子3基因降低MMP9的表达。通过此试验证明了组织金属蛋白酶抑制因子3基因受另外一个反式作用元件miR-21的调节。
　　 组织金属蛋白酶抑制因子3基因和hsa-miR-1在关节炎,癌症,以及心脏病中均异常表达,这为探索其致病机理,以及基因治疗这些疾病提供了线索。组织金属蛋白酶抑制因子3基因在心肌肥大和心力衰竭中表达降低,而miR-21在这些心血管疾病中异常升高。TIMP3和MMP9是参与心肌重构的重要分子。而心力衰竭的基础就是心肌重构。实验结果提示了通过抑制miR-21在心肌肥大和心力衰竭中的异常表达,有望调控心肌重构途径。由于miR-21在多种癌症中表达上调,而组织金属蛋白酶抑制因子3基因在这些癌症中表达沉默。以往的观点认为这可能是由于组织金属蛋白酶抑制因子3基因启动子甲基化引起,但是并非所有癌症都发现了组织金属蛋白酶抑制因子3基因启动子的甲基化,我们的研究为合理解释这一现象提供了开创性的提议和验证,就是miRNAs有可能是组织金属蛋白酶抑制因子3基因在癌症和心血管疾病中经常沉默的因为。

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