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所谓肺硬化性血管瘤中的两种主要细胞的基因表达差异及意义

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论文一 所谓肺硬化性血管瘤组织中两种主要细胞的基因表达差异及意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

论文二 P53蛋白表达和基因突变在所谓肺硬化性血管瘤两种主要细胞中的意义

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 所谓肺硬化性血管瘤的研究进展

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摘要

肺硬化性血管瘤(pulmonary sclerosing hemangioma)是由Liebow和Hulbell首先报道的肺部较为少见肿瘤，约占肺肿瘤的2—3％，最初认为是黄色瘤或错构瘤，长期以来被归类于肺的炎性假瘤范畴。随着时间的推移，人们逐渐认识到：肺的硬化性血管瘤并不是肺的炎性假瘤，而是一种实实在在的“良性”真性肿瘤，尽管其发病率较低，但由于临床CT、磁共振等影像学检查极易与肺癌相混淆，更为严重的是术中冰冻病理诊断又极易误诊为肺腺癌、细支气管肺泡癌以及类癌等，因而手术切除常常过度，给患者造成损害，所以对该肿瘤的研究和诊断备受重视。在我们的研究中，为了区分该肿瘤并不是炎性假瘤，也为了将来能够有一个更适合该肿瘤的名字。我们将该肿瘤称之为“所谓的肺硬化性血管瘤”(So—called pulmonary sclerosing hemangioma，PSH)。由于该肿瘤一般呈良性临床经过，与其相平行的名称还有：良性乳头状神经内分泌肿瘤，良性肺泡细胞瘤，良性肺腺瘤，错构瘤等。之所以出现这些名称，是因为到目前为止PSH的起源尚不清楚。有人认为来源于内皮细胞、间皮细胞、肺泡上皮细胞、神经内分泌细胞等，最近还有人提出是来源于多潜能的原始呼吸道上皮细胞的观点。在新版的WHO分类当中，也只好将该肿瘤暂时放入“未定类肿瘤”当中。有人还对该肿瘤当中两种主要形态不同的细胞是否为同一起源提出了质疑，并观察到部分肿瘤术后若干年出现了复发和转移的现象。 针对PSH的分类困难、影像和病理诊断困难、起源不明、生物学特性不清的特点，我们收集了40余例的PSH资料，利用免疫组化、激光捕获微切割(LCM)、RT-PCR、单链构象多态性分析和DNA测序分析等方法，对该肿瘤进行系统深入的研究，期望找到能正确诊断该肿瘤的方法，并对其起源及生物学行为方面作以探讨。 材料与方法： 1、材料 收集中国医科大学第一临床学院1995～2004年间病理诊断为PSH及手术切除病变旁正常肺组织蜡块标本40例。选其中17例女性，2例男性具有完整临床资料的病例进行基因表达方面的研究。该19例当中，12例无自觉症状，为体检时发现；7例有症状者分别表现为胸痛、咳嗽、痰中带血。胸部X线片或胸部CT显示均为孤立性肿块，多位于肺的周边，呈圆形、卵圆形高密度影，边缘光滑，无毛刺及分叶状改变。肿块位于右肺11例，左肺8例。未发现多发病灶及转移病例。发病时间为15天至5年不等。 2、免疫组化 选用单克隆抗体细胞角蛋白(cytokeratin L，CK—L)、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)标记上皮性抗原，SP—B和TTF—1标记原始呼吸道上皮细胞或肺泡Ⅱ型细胞，波形蛋白(vimentin，VT)标记间叶来源细胞，CD34标记内皮来源细胞，CD68标记巨噬细胞，神经元特异性烯醇化酶(neuron specific endolase，NSE)和突触素(synaptophysin，Syn)标记神经内分泌来源的细胞以及单克隆P53抗体(D0-7)。上述即用型抗体及S-P超敏试剂盒均购自福州迈新物技术公司。将蜡块标本制成4μm连续切片，经脱蜡、脱苯、水化后进行HE和链菌素抗生物素蛋白—过氧化物酶(S-P法)免疫组化染色。以已知阳性组织为阳性对照，PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。每张切片随机选取5个高倍视野，每高倍视野计数100个瘤细胞，无着色及阳性细胞数<5％为(-)，阳性细胞数>5％为(+)。CK—L、SP—B、Vimentin、CD34、CD68、NSE、Syn阳性表达的判断为单纯胞质表达；EMA阳性表达的判断为膜/质表达；TTF—1、p53阳性表达的判断为单纯核表达或核、胞质同时表达。 3、激光捕获目的细胞、提取总RNA 取病变组织蜡块，制成6μm连续切片，Mayer's苏木素—伊红染色，二甲苯透明，切片晾干，放置在激光捕获显微切割(lasercapture microdissection，LCM)系统(LM200型)的倒置显微镜的载物台上。将附有一层乙烯乙酸乙烯酯薄膜(et hylenevinylacetate polymer，EVA)的扁平塑料帽紧密覆盖在切片的表面。定位光束标定被选细胞，发射激光束，分别捕获PSH组织中表面立方细胞和多角形细胞。每份标本分别捕获5000～10000个目的细胞。按照PieoPureTM RNA Isolation Kit说明书操作提取总PdqA(Arcturus Bioscience，Mt．View，CA)。 4、RT-PCR 按照RiboAmp()HS RNA Amplification Kit说明书操作。PCR扩增产物使用1.5％琼脂糖，100V电泳35min，溴化乙啶(EB)染色，凝胶成像系统(BioImageing System，UVP，CA)下观察。以β—actin为内对照。 5、DNA提取、P53基因PCR扩增、SSCP及测序分析 将捕获的PSH组织中表面立方细胞和多角形细胞加入预先加有50μL DNA裂解液(10 mmol/L Tris HCl，pH8.0；1 mmol/L EDTA PH8.0；1％Tween20；200 mg/L蛋白酶K)的0.5 mL离心管上。48℃水浴14 h，95℃10 min灭活蛋白酶K，—20℃保存备用。分别取多角形细胞和立方细胞的DNA模板各10μL于50μL PCR反应体系进行P53基因(5～8外显子)PCR扩增。取6μL PCR产物加等量变性上样缓冲液混匀后，100℃热变性10 min后迅速置于冰水浴中冷却5 min，然后上样于10％非变性聚丙烯酰胺凝胶(49：1)中；每组均以病变旁正常肺组织作对照。恒温电泳。凝胶经硝酸银染色。判断标准：待测样品的电泳带与正常对照的电泳带相比，若出现条带的增加、减少或位置的移动，即说明该样品存在着基因突变。同时取剩余的p53基因(5～8外显子)扩增产物(40μL左右)进行测序分析(上海联合基因测序部)。 结果： 1、组织学改变 PSH组织形态多样，由实性区、乳头区、血管瘤样区和硬化区四种基本结构构成，并有不同程度的相互移行。肿瘤细胞主要有两种：一种是位于实性区和乳头区内的多角形瘤细胞，胞浆淡染或嗜酸，核圆或卵圆形，有小核仁，罕见或无核分裂像。另一种是被覆在乳头表面、血管瘤样区间隙及实性区裂隙内的细胞，多呈矮立方状，形态与肺泡Ⅱ型细胞极为相似，可融合成多核巨细胞，但无异型性。间质内可见较多的肥大细胞和以淋巴细胞为主的各种炎性细胞浸润，还可见含铁血黄素沉积、钙化和骨化等。多核瘤巨细胞和硬化性乳头的出现，是造成诊断困难的原因之一。 2、免疫组化结果 在40例PSH标本中，CK—L、EMA和SP—B只表达在表面立方上皮细胞或实性区内陷的立方上皮细胞和血管瘤样区的内衬上皮细胞，而间质多角形细胞为阴性；Vimentin则只表达于间质的多角形细胞；TTF—1在两种细胞内均有表达；CD34只在血管内皮细胞表达，在两种细胞内均无表达；多核瘤巨细胞则表达CK—L，SP—B和TTF—1，而CD68为阴性。此外，间质多角形细胞少量表达Syn和NSE。19例PSH组织中，3例(15.8％)标本p53蛋白呈阳性表达，且多角形细胞的表达强度高于表面立方细胞的表达；15例(78.9％)p53蛋白呈阴性表达，其中1例标本虽有p53蛋白呈阳性反应的细胞，但阳性细胞数≤5％。 3、RT-PCR结果 应用LCM方法，分别提取19例PSH当中的两种细胞的mRNA，RT-PCR扩增电泳后，所谓肺硬化性血管瘤组织中的两种细胞，其基因表达有着明显的区别，表面立方细胞有明确的CK、EMA、SP—B和TTF—1的mRNA表达，而间质内的多角形细胞有明确的Vimentin、Syn和TTF—1的表达，同时有弱的EMA的表达。两种细胞都未见Ch—A的表达。这一结果与免疫组化的蛋白表达结果极为相似。 4、SSCP及测序分析 SSCP法检测19例PSH组织P53基因突变，3例(15.8％)标本出现异常移动带，1例发生在第6外显子上，2例发生在第7外显子上，第5及第8外显子未见异常；在这3例突变中，单一多角形细胞突变2例，立方细胞和多角形细胞同时突变1例。DNA测序分析结果显示19例PSH组织中，P53基因的突变率为15.8％(3/19)；单一多角形细胞突变2例，多角形细胞和立方细胞同时突变1例；1例发生在第6外显子；2例发生在第7外显子，第5、8外显子未见突变；3例均为错义突变。 结论： 1、PSH组织当中的多核瘤巨细胞是表面立方细胞的融合，多核瘤巨细胞和硬化性乳头的出现，是造成病理诊断困难的主要原因之一。 2、PSH组织中的多角形细胞和表面立方细胞在形态表型上的差异可能是由于所处不同的分化状态所致，表面立方细胞趋向肺泡Ⅱ型细胞分化，而间质内的多角形细胞则具有多向分化的潜能。 3、PSH中两种细胞均可有突变型P53蛋白表达；多角形细胞中突变型p53蛋白表达率明显高于立方细胞；PSH中两种细胞均存在DNA错义突变，且间质多角形细胞突变高于表面立方细胞；P53蛋自表达与基因突变检测结果一致，提示PSH具有潜在恶性的可能。

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