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慢性砷中毒皮肤色素细胞改变特点及砷、紫外线对色素代谢影响的研究

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中国医科大学研究生学位论文独创性声明及版权使用授权书

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英文缩略语

论文一 慢性饮水型砷中毒人群发、尿、血砷含量及皮肤色素细胞改变特点

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文二 亚砷酸钠对人类黑色素瘤G361及A375细胞系色素代谢影响的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

论文三 亚砷酸钠与紫外线联合作用对人类黑色素瘤G361细胞系色素代谢影响的研究

前言

材料与方法

实验结果

讨论

结论

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 砷暴露致皮肤损伤的研究进展

在学期间科研成绩

致谢

个人简介

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摘要

本研究采用人类黑色素瘤细胞株作为研究对象，将TYR作为靶点，初步探讨砷致黑色素细胞黑色素代谢异常的机制，并探讨单纯紫外线暴露与砷和紫外线联合作用是否存在差异，即砷是否对紫外线的促黑素化具有协同作用。目的流行病学研究部分：调查砷中毒患者水砷暴露情况及发、尿、血中各种砷化物的含量；通过皮肤病理学方法观察患者皮肤损伤情况，特别是黑色素细胞。 实验研究部分：以TYR为靶点，初步探讨砷致黑色素细胞黑色素代谢异常的机制，并探讨单纯紫外线暴露与砷和紫外线联合作用是否存在差异，即砷是否对紫外线的促黑素化具有协同作用。 方法： 1、流行病学调查选择内蒙古自治区五原地区的某个慢性砷中毒病区作为调查地区。根据《地方性砷中毒诊断标准》(WS/T211-2001)，从所有自愿参与的被调查对象中确定砷中毒患者人群共26人(男17人，女9人)；对照人群10人(男女各5人)。 2、水砷浓度及人群发砷、尿砷、血砷水平的测定水砷浓度测定采用高效液相色谱法。发砷、尿砷、血砷水平测定采用超低温捕获-还原气化-原子吸收分光光度法。 3、人群皮肤病理检查以皮肤采样器采集皮肤样品，HE染色。 4、人类黑色素瘤细胞G361及A375细胞系培养培养于含10％小牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM：培养基中。细胞在37℃、5％CO<,2>的培养箱中常规培养。 5、细胞活力检测CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay检测。 6、黑色素测定黑色素瘤细胞G361及A375施加相应处理因素(单纯砷作用、单纯紫外线作用或砷与紫外线联合作用)后，消化、收集细胞，取10<'6>个细胞，加入1mol/L的NaOH/10％DMSO 1ml，100℃加热30min后，以合成黑色素(synthetic melanin)为标准物，用酶标仪测定400nm波长的吸光度值。黑色素的最终含量以pg/cell表示。 7、TYR活力测定黑色素瘤细胞G361施加相应处理因素(单纯砷作用、单纯紫外线作用或砷与紫外线联合作用)后，消化、收集细胞，取10<'6>个细胞，加入PBS(其中含0.1mmol/L PMSF，0.5％Triton X-100，PH 6.8) 0.5ml,超声破碎细胞，离心(1000g，10min)。取上清50μl，加入至含0.1mmol/L酪氨酸、2μCi/ml[<'3>H]酪氨酸、0.1mmol/L L-DOPA、0.1mmol/L PMSF的PBS中(0.1 mmol/L，PH6.8)，总体积为500μl。37℃培养箱中孵育2h后，加入1ml活性炭(10％w/v in HCl)。充分振荡30s，离心(2000g，10min)。取上清100μl，加5ml scintillation fluid，在TM scintillation spectrometer上，以Mushroom Tyrosinase为标准物质，测定TYR活力。活力结果以对照组的％表示。 8、TYR的mRNA表达水平的测定黑色素瘤细胞G361及A375施加相应处理因素(单纯砷作用、单纯紫外线作用或砷与紫外线联合作用)后，以Trizol法提取细胞总RNA。按照real-time PCR试剂盒要求操作，进行real-time PCR。 9、细胞凋亡水平的测定黑色素瘤细胞G361及A375施加相应处理因素后，用MEBCYTO Apoptosis Kit试剂盒法测定细胞凋亡发生水平。 10、统计分析采用SPSS13.0统计软件，计量资料以x±s表示，以单因素方差分析(ANOVA)进行统计学分析，所有实验结果均来自3个平行样品或3次重复实验，以P<0.05表示统计学显著差异。 结果： 砷中毒患者饮用水中无机三价砷(AsⅢ)、无机五价砷(AsV)、有机砷及总砷(tAs)水平均显著高于对照人群。毛发中无机砷(iAs)、二甲基砷(DMA)及tAs水平，尿iAs、甲基砷(MA)、DMA及tAs水平，血MA及DMA水平均显著高于对照人群。 病理检查中，黑色素细胞出现的异常变化或损伤表现包括：黑色素产生增多；黑色素细胞出现凋亡。其它皮肤损伤表现包括：真皮乳头减少，基底层增厚，出现异型核细胞；表皮层紊乱、基底层液状变性、真皮水肿、真皮细胞浸润、角质形成细胞核浓缩等。 两种黑色素瘤细胞暴露于NaAsO<,2> (0.01及0.1μmol/L)，细胞活力轻度增高，但与对照组相比无显著差异。NaAsO<,2>浓度大于0.5μmol/L时，随着暴露浓度增高，细胞活力呈下降趋势。其中，暴露24h的5、10及25μmol/L浓度组和暴露48h的0.5、1、5、10及25 μmol/L浓度组的细胞活力与对照组相比显著降低。 亚砷酸钠(NaAsO<,2>，0.1及1μmol/L，72h)作用于两种黑色素瘤细胞，黑色素水平与对照组相比无显著差异；TYR活力亦无显著差异。NaAsO<,2>短时、低浓度(0.1及1 μmol/L)作用于G3 61细胞，TYR mRNA的表达水平与对照组相比无显著变化；短时、高浓度作用(5、10及20μmol/L)时，12h-10μmol/L、24h-5μmol/L、24h-20μmol/L、48h-5μmol/L及48h-10μmol/L组TRY的mRNA的表达水平与同一培养时段对照组相比显著降低；长期慢性、低浓度作用(0.1μmol/L，16w)时，暴露8周的mRNA表达水平显著高于对照组。 不同浓度NaAsO<,2>作用于两种黑色素瘤细胞(1、5、10、20 及40μmol/L)时，细胞凋亡发生率随着砷作用浓度增加而增高，其中，20及40 μmol/L组细胞凋亡发生水平显著高于对照组。 不同浓度NaAS02(0.1及1μmol/L)与不同强度UV(5mJ/cm<'2>、10mJ/cm<'2>)联合作用(72h)时发现，10mJ UV组、10mJ UV+0.1μM As组及10mJ UV+1 μM As组的黑色素水平显著高于5mJ UV组、5mJUV+0.1μM As组及5mJ UV+1μM As组及对照组。10mJ UV组、10mJUV+0.1μM As及10mJ UV+1μM As组间黑色素水平无显著差异。各组TYR活力及mRNA表达水平与对照组相比亦无显著差异。 两种细胞系的无砷处理对照组中，G361细胞系的黑色素水平显著高于A3 75细胞系的黑色素水平(p=0.0009)；G361细胞系的TYR活力水平(3273.5±12.9 CPM<'3>[H])显著高于A375细胞系的TYR活力水平(2520.2±12.4 CPM<'3>[H])(p=0.0003)；同样浓度的NaAsO<,2>、相同条件作用于此两种细胞系后，引发的凋亡发生率水平间存在很大差异。其中，NaAsO<,2>作用浓度为20及40μmol/L时，G361细胞系的凋亡发生水平显著高于A375细胞系。 结论： 长期慢性砷暴露患者体内的砷化物中，MA水平相对较高，砷性皮肤病理改变可能与血液中高水平的MA关系密切。砷性皮肤色素脱失可能与砷致黑色素细胞发生凋亡有关。 低浓度NaAsO<,2>长期慢性作用于黑色素瘤G361细胞系可引起TYR的mRNA表达水平增高，从而在转录水平上提高TYR的表达，进而增加黑色素的产生。这很可能是造成砷性皮肤色素沉着的发生原因。 砷暴露可引起黑色素瘤G361及A375细胞系凋亡发生水平显著增高。而凋亡的发生，很可能与砷性色素脱失关系密切。 G361细胞系在黑色素的本底水平、TYR活力的本底水平，以及在相同浓度NaAsO<,2>作用下细胞凋亡发生率的水平上均显著高于A375细胞系，说明个体间在黑色素代谢方面的个体差异很可能是造成对同样暴露条件下个体间反应差异的主要原因。 NaAsO<,2>与10mJ UV联合作用引起的黑色素水平增高可能与TYR关系不大，而是通过其它信号调节途径诱导而来。砷对紫外线的促黑素化作用没有协同效应。

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