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非小细胞肺癌中ASC基因启动子甲基化及甲基化抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷对肺癌细胞株增殖抑制的实验研究

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论文一5-aza-CdR诱导甲基化失活的ASC基因重新表达以及促进肺癌细胞凋亡的实验研究

论文二非小细胞肺癌中ASC基因启动子甲基化与患者临床病理特征及预后的关系

论文三5-氮-2'-脱氧胞苷体外诱导肺腺癌细胞凋亡及与化疗药物的协同作用的试验研究

本研究创新性的自我评价

参考文献

综述 肺癌中DNA甲基化的生物学和临床意义

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致 谢

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摘要

近年来，肺癌在发达国家已占据所有恶性肿瘤发病率的首位，在发展中国家其发病率也在呈明显的上升趋势。尽管在过去的20年中肺癌的检测和治疗手段得到了改进，但患者总的5年生存率不足15％，并且肺癌的生存率在过去的二十年中几乎无任何显著的改变。在肺癌中以非小细胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma，NSCLC)最多，约占肺癌的85％，便于取得病理标本，是肺癌中研究最为深入的病理类型。对NSCLC的深入研究是提高肺癌病人长期生存率的关键，也是国内外学者多年来关注的焦点。 癌基因和抑癌基因的改变是肿瘤发生发展的基础已得到公认。过去的研究大多集中在基因结构和数量上，认为基因的突变、缺失等染色体改变是肿瘤形成的关键。近几年来，随着后基因组时代的到来，表遗传学(epigenetics)研究越来越受到重视。DNA甲基化是表遗传学上研究最深入的一种机制。最近的研究表明，肿瘤相关基因甲基化不但在肿瘤的形成过程中起重要作用，而且，有可能成为肿瘤早期诊断的分子生物学指标和肿瘤基因治疗的靶点之一。 在肿瘤DNA甲基化的研究中，抑癌基因甲基化是目前国内外研究的焦点。抑癌基因甲基化是抑癌基因失活的一种重要机制，它发生在位于基因5'端相连的富含CpG二核苷酸的启动子区域，这一区域被称为CpG岛(CpGisland)。甲基化的DNA募集甲基结合蛋白，吸引一个和蛋白相连的染色体重塑复合物，然后通过去乙酰作用修饰组蛋白，从而关闭了基因的转录。 迄今为止，针对肿瘤抑制基因(tumorsuppressgenes，TSG)甲基化在肺癌发病机制中的作用已进行了广泛的研究。抑癌基因甲基化在肺癌的发病·1·机制中起着重要作用，可能是肺癌形成过程中的一个早期事件；另外，抑癌基因甲基化有可能成为肺癌早期诊断以及监测治疗效果或预后的具有高度特异性和敏感性的生物学指标；去甲基化药物使抑癌基因再表达也可能成为肺癌治疗的一种新方法。 最近，Masumoto和Conway分别通过不同的方法分离鉴定了一个新的基因ASC(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD)也被称为TMS1(Targetofmethylation-inducingsilencing)。ASC基因位于染色体16p11.2-12.1，编码一个含有CARD℃aspaserecruitmentdomain)的22kDa蛋白，具有促进凋亡的作用。研究表明，黑色素瘤、大肠癌和卵巢癌肿瘤组织及细胞系中均存在ASC基因由甲基化导致的基因静默。ASC基因甲基化与上述肿瘤的形成和进展有关。目前有关ASC基因在肺癌中的确切作用仍知之甚少。目前可检索到的唯一一篇有关肺癌中ASC基因甲基化的报道是Arvind等2003年发表的。在他们的研究表明，ASC异常甲基化可见于48％的非小细胞肺癌细胞系和40％的非小细胞肺癌肿瘤组织，并认为ASC基因甲基化可能与NSCLC的形成有关。有鉴于此，我们准备在非小细胞肺癌肿瘤组织、瘤旁正常肺组织及非小细胞肺癌细胞系中检测ASC基因的异常甲基化情况并分析其与非小细胞肺癌肿瘤细胞凋亡之间的关系，探讨其在非小细胞肺癌形成和发展中的作用并为去甲基化药物治疗肺癌的基因靶点提供理论依据。 本文通过实验得出如下结果： 1.ASC基因启动子甲基化与NSCLC临床特征之间的关系48例NSCLC的冰冻肿瘤组织和相应的正常组织标本中ASC基因甲基化的检测发现，NSCLC肿瘤组织与相对应的正常肺组织中ASC基因启动子甲基化的发生率分别为47.9％(23/48)和8.3％(4/48)，有显著差异(P＜0.001，χ2=18.65)。存在ASC基因启动子甲基化的正常肺组织均来自于有重度吸烟史的鳞癌患者中，并且其相应的肿瘤组织中均存在ASC基因的甲基化。重度吸烟患者的肿瘤组织中ASC基因启动子甲基化的发生率明显增高(p=0.0089，χ2=6.8363)。另外，非小细胞肺癌的肿瘤大小也与ASC基因启动子甲基化有关，较小的肿瘤组织中ASC基因启动子甲基化率明显高于较大的肿瘤组织(p=0.335，χ2=4.5223)。研究还表明，ASC基因·5·启动子的甲基化由于病人的年龄、性别、肿瘤的病理类型以及淋巴结转移情况无关。 2.ASC基因启动子甲基化与患者预后的关系70例有完整随访资料的NSCLC石蜡标本经MSP检测并分析肿瘤组织中ASC基因启动子甲基化与患者预后的关系。结果显示，不同病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移以及有否ASC基因启动子甲基化分别与患者的五年生存的可能性之间均存在明显的关系，ASC基因启动子甲基化阳性患者的5年生存率显著降低(P=0.007，χ2=7.338)。我们进一步采用Cox比例风险模型进行回归分析，其中除肿瘤分期、淋巴结转移情况外，ASC基因启动子甲基化状态亦是独立的预后因素(P=0.009，回归系数-1.035，风险度0.355，95％可信区间0.164-0.769)。 3.肺癌细胞系中ASC基因启动子的甲基化状态甲基化特异性PCR(MSP)检测显示，在本研究所应用的三个肺癌细胞系中，仅有A2细胞系存在明显的ASC基因异常甲基化，其他两个细胞系A549和calu-3并无ASC基因甲基化的存在。 4.5-aza-CdR对甲基化的ASC基因表达的逆转及诱导凋亡作用对存在ASC基因异常甲基化的A2细胞系应用5-aza-CdR进行诱导，经RT-PCR检测ASC基因在RNA水平上的表达情况。结果显示，经5-aza-CdR处理后，ASC基因在RNA水平的表达上发生了逆转，由原来的不表达转变为重新表达。而且，随着5-aza-CdR浓度的增加，ASC基因表达水平有增强的趋势。然而。流式细胞检测显示，5-aza-CdR处理后，无论是否有ASC基因启动子异常甲基化的存在，肺癌细胞系A649、A2、calu-3均出现了明显的凋亡。而且，无论有否ASC基因启动子的甲基化，三个细胞系凋亡率的并无明显的区别。 5.5-aza-CdR对肺癌细胞增殖的抑制经MTT检测发现，5-氮-2'-脱氧胞苷对肺癌细胞株的增殖有明显的抑制作用，且这种作用具有剂量和时间依赖性。在浓度达到1.0ul时即出现了对细胞的生长抑制作用，应用寇氏计算法计算48小时IC50为4.20±0.12umol/L。在一定的范围内，随着剂量的增高和作用时间的延长，对肺癌细胞增殖的作用越明显。 6.5-aza-CdR与化疗药物的协同作用Vp-16、ADM和DDP对A2肺癌细胞株的半数致死量分别为0.·6·25μmol/L、5.0μg/ml、0.25μg/ml。应用较低浓度的5-氮-2'-脱氧胞苷诱导24h后，在加入上述浓度的各种化疗药物。结果显示，Vp-16、ADM组的细胞存活率分别下降了25.3±2.6％和27.1±3.1％，而DDP组的下降不明显。 结论： 1.非小细胞肺癌肿瘤组织中存在ASC基因启动子的频繁甲基化。 2.ASC基因启动子甲基化可能与吸烟引起的肺鳞癌的发生有关。 3.ASC基因启动子甲基化可能是非小细胞肺癌发生的早期分子学改变。 4.ASC基因启动子甲基化是影响NSCLC病人预后的独立因素。 5.肺癌细胞系中存在因甲基化引起的ASC基因RNA表达的缺失。 6.甲基化的ASC基因可以5-AZA-CdR逆转而获得重新表达。 7.5-AZA-CdR可以诱导肺癌细胞凋亡的发生。 8.5-AZA-CdR诱导的肺癌细胞系凋亡并非因单一的ASC基因去甲基化而引起的。 9.5-azaCdR对A2肺癌细胞株的增殖有明显的抑制作用。 10.5-aza-CdR与Vp-16、ADM在抑制A2肺癌细胞株细胞的增殖方面存在协同作用。

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