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小鼠原始生殖细胞的分离鉴定及其迁移的表观遗传调节研究

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第一部分综述部分原始生殖细胞概述

1 PGCs的特化

2 PGCs的特化机制

3 PGCs的迁移

4 PGCs的凋亡

5 PGCs发育过程中的表观遗传重编程

6 小结

参考文献

第二部分实验研究部分

第一章小鼠原始生殖细胞的分离和鉴定

引言

材料与方法

结果

讨论

第二章小鼠PGCs迁移过程中的基因表达及表观遗传修饰

引言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

结论

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摘要

原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)是雌性和雄性生殖细胞的前体细胞，是有性生殖生物生存及繁衍后代的重要细胞。哺乳动物PGCs起源于胚胎上胚层，于E7.5从卵黄囊开始迁移，经过后肠内胚层到达背肠系膜。在迁移过程中PGCs不断分裂增殖，最终于E13.5到达生殖嵴，在此分化为卵母细胞和精母细胞。在PGCs迁移过程中涉及细胞命运决定、细胞与细胞相互作用、细胞迁移和表观遗传重编程等重要的细胞活动，因此PGCs的分离纯化对于研究其增殖、迁移等过程至关重要。
　　本研究利用流式细胞方法，对小鼠PGCs细胞进行了分离与鉴定，并对迁移过程中相关基因的表达及表观遗传调节进行了研究。
　　1.小鼠PGCs细胞的分离与鉴定
　　本实验以E10.5和E13.5小鼠胚胎为实验材料，首先通过免疫组化对胚胎中SSEA-1和OCT-4的定位予以确定。然后分别取E10.5胚胎的后1/3部分和E13.5胚胎的生殖嵴，经0.05％的胰酶消化制成单细胞悬液后进行SSEA-1流式细胞分选，将富集的细胞进行碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）和SSEA-1染色鉴定，并通过实时荧光定量PCR检测分选细胞中PGCs标记基因（Fkbp6、Mov10l1、4930432K21Riken、Spo11）、多能性基因（Nanog、Oct4）及生殖相关基因(Mvh、Dazl)的表达情况。免疫荧光观察结果显示SSEA-1和OCT-4定位于E10.5胚胎的背肠系膜，SSEA-1定位于E13.5胚胎的生殖嵴。利用SSEA-1分选E10.5和E13.5胚胎的阳性细胞分选率分别为3±1.41％和10.12±2.56％，分选后细胞的AKP阳性率均为90％左右、SSEA-1染色均呈阳性。实时荧光定量PCR结果显示，E10.5和E13.5胚胎分选后的细胞中PGCs标记基因Fkbp6、Mov10L1、4930432K21Riken、Spo11的表达均显著高于SSEA-1阴性细胞(P＜0.001)，E13.5的分选细胞中的多能性基因Nanog、Oct4和生殖细胞特异性基因Mvh、Dazl的mRNA丰度均显著高于E10.5的细胞(P＜0.001)。上述结果表明流式分选获得的细胞具备PGCs的细胞特性。
　　2.小鼠PGCs迁移过程中的基因表达及其表观遗传调节
　　为了进一步探讨PGCs迁移的分子调控机制，以E10.5和E13.5 PGCs为实验材料，研究基质金属蛋白酶及其组织特异性抑制因子在两个时期PGCs的表达、亚细胞定位等。实时荧光定量PCR结果表明，与E13.5 PGCs相比，在E10.5PGCs中Mmp2、Mmp9高表达，MT1-Mmp显著高表达(P＜0.001);E13.5 PGCs中Ti mp1、Timp2和Ti mp3的表达均显著高于E10.5(P＜0.001)。经SSEA-1和MT1-MMP流式双选和免疫荧光结果表明，在E13.5 PGCs中检测到MT1-MMP，而E10.5 PGCs中未检测到。利用亚硫酸盐PCR测序检测DNA甲基化对以上基因表达的调节，结果显示，与E10.5 PGCs相比，在E13.5 PGCs中Mmp2启动子区甲基化水平没有显著变化，Timp1启动子区甲基化水平明显提高19％(p＜0.05)，Ti mp3显著降低了16％(P＜0.05)，说明启动子区DNA甲基化水平的变化与Ti mp1、Timp3在不同时期PGCs中的表达差异有关。
　　综上所述，本研究利用特异性SSEA-1标记分选的细胞高表达PGCs特性基因、多能性基因和生殖相关基因，符合PGCs的细胞特性。MMP/TIMP在E10.5和E13.5 PGCs中动态调节，MT1-MMP的高表达可能促进了PGCs从发生部位定向迁移到生殖嵴。另外，MMP/TIMP分子的表达与其基因调节区DNA甲基化相关，在E13.5 PGCs中Timp3的低甲基化导致其表达上调。

著录项

作者
王淑梅;
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作者单位

内蒙古大学;

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授予单位内蒙古大学;
学科动物学
授予学位硕士
导师姓名于海泉;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类生殖细胞（配偶子）;
关键词
原始生殖细胞; 分离鉴定技术; 细胞迁移; 基因表达; 表观遗传学;

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