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蛋氨酸及含蛋氨酸二肽对奶牛乳腺上皮细胞内乳蛋白合成相关基因表达的影响

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1 引言

1.1乳蛋白的构成及其营养功能

1.1.1乳蛋白的构成

1.1.2 乳蛋白的主要营养功能

1.2.1 乳蛋白的合成

1.2.2 调控乳蛋白合成的因素

1.3小肽在奶牛乳蛋白合成中的作用

1.3.1 小肽对奶牛产奶量和乳蛋白合成的影响

1.3.2乳腺对小肽的摄取机制

1.3.3 影响乳腺对小肽利用的因素

1.4 研究目的、意义及内容

1.5 论文总体技术路线

2.研究内容

2.1蛋氨酸浓度及培养时间对奶牛乳腺上皮细胞活力及乳蛋白基因表达的影响

2.1.1 试验材料与方法

2.1.2 结果

2.1.3 讨论

2.1.4 小结

2.2 含蛋氨酸二肽对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白合成相关基因表达的影响

2.2.1 试验材料与方法

2.2.2 数据处理

2.2.3 结果

2.2.4 讨论

2.2.5 小结

3.1.1 适宜二肽组合的确定

3.1.2 二肽等量替代氨基酸促进乳蛋白基因表达的可能机理

3.2 总体结论

4 本文的创新之处

5 对未来研究的展望

致谢

参考文献

作 者 简 介

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摘要

本试验运用体外培养的奶牛乳腺上皮细胞为模型，研究蛋氨酸及含蛋氨酸二肽等量替代其所含的游离氨基酸后对乳腺上皮细胞中乳蛋白合成及相关基因表达以及细胞内外氨肽酶蛋白含量的影响，为深入研究小肽对奶牛乳蛋白合成机理及改善乳品质提供了理论基础。
　　试验由两个试验构成：
　　试验一主要研究了蛋氨酸浓度及培养时间对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因表达的影响，筛选出最适培养浓度及培养时间。取健康的荷斯坦奶牛乳腺组织，分离纯化得到乳腺上皮原代细胞，待细胞融合度达到80％时进行传代。试验采用单因子完全随机试验设计，将第3代乳腺上皮细胞随机分为6个处理组，每组6个重复，每组分别加入不同剂量的游离蛋氨酸，使其培养液中的终浓度分别为0、20、40、60、80和100μg/mL，其中0μg/mL为对照组，其余为试验组。将细胞培养板置于37℃、5%的CO2培养箱中分别培养24h、48h和72h。试验结果表明：用不同浓度的游离蛋氨酸培养奶牛乳腺上皮细胞，当培养48h时，乳腺上皮细胞活力和αs1-酪蛋白（αs1-casein，CSN1S1）、?-酪蛋白（?-casein，CSN3）和β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，LGB）基因表达量随着蛋氨酸浓度的增加呈显著的一元二次曲线增加，当浓度达到60μg/mL时，表达量最高；但蛋氨酸的添加抑制了β-酪蛋白（β-casein，CSN2）基因的表达；当培养72h时，所有浓度的蛋氨酸均抑制了细胞增殖。蛋氨酸的添加浓度为60μg/mL、培养时间为48h时，乳腺上皮细胞的活力以及细胞中乳蛋白基因的表达量均较高。
　　试验二研究了八种含蛋氨酸二肽等量替代其所含的游离氨基酸后对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因（CSN1S1、CSN2、CSN3、LGB）、Ⅱ型小肽转运载体基因（PEPT2）、氨肽酶氮基因（APN）表达以及细胞内外氨肽酶（APA）含量的影响。在试验一的基础上，将蛋氨酸与其它必需氨基酸分别组成八种二肽（蛋氨酸-蛋氨酸(P-Met-Met)、蛋氨酸-赖氨酸(P-Met-Lys)、蛋氨酸-色氨酸(P-Met-Trp)、蛋氨酸-苯丙氨酸(P-Met-Phe)、蛋氨酸-苏氨酸(P-Met-Thr)、蛋氨酸-异亮氨酸(P-Met-Ile)、蛋氨酸-亮氨酸(P-Met-Leu)、蛋氨酸-缬氨酸(P-Met-Val)），等量替代相应的游离氨基酸（F-Met-Met、F-Met-Lys、F-Met-Trp、F-Met-Phe、F-Met-Thr、F-Met-Ile、F-Met-Leu、F-Met-Val）。试验二分为三个部分：第一部分研究了八种二肽对奶牛乳腺上皮细胞CSN1S1、CSN2、CSN3、LGB、PEPT2、APN基因表达以及细胞内外 APA活性的影响。采用单因子随机试验设计分为9个组，8个二肽组与空白对照组。结果表明：P-Met-Met和P-Met-Lys组较对照组和其它二肽处理组显著上调了CSN1S1、CSN2和CSN3基因的表达，P-Met-Met组优于P-Met-Lys组。P-Met-Thr、P-Met-Leu、P-Met-Ile和 P-Met-Val组抑制了 CSN2基因和CSN3基因的表达。
　　第二部分研究了与八种二肽对应的游离氨基酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因、PEPT2、APN表达以及细胞内外APA活性的影响。采用单因子随机试验设计分为9个组，8个氨基酸组与空白对照组。结果表明，F-Met-Met和F-Met-Lys组较对照组和其它氨基酸处理组显著地促进了 CSN1S1基因的表达。F-Met-Thr组较其它氨基酸处理组显著抑制了CSN3基因的表达。PEPT2基因表达量的结果表明，F-Met-Ile组显著低于空白对照组，但F-Met-Met组显著高于F-Met-Trp、F-Met-Leu、F-Met-Ile和F-Met-Val氨基酸处理组，但与对照组无显著差异。不同氨基酸处理组对APN基因表达无显著的影响。第三部分研究了二肽等量替代相应游离氨基酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白基因、PEPT2、APN表达以及细胞内外APA活性的影响。结果表明，除P-Met-Val和P-Met-Leu外，不同二肽组合替代氨基酸后均不同程度地促进了乳蛋白基因和 PEPT2基因的表达量，以P-Met-Met表现出较好的促进效果，显著上调了乳蛋白 CSN1S1、CSN2、CSN3基因的表达量， PEPT2的基因表达量有趋于显著的提高；以 P-Met-Trp、P-Met-Phe、P-Met-Lys的促进效果次之。
　　二肽等量替换游离氨基酸能够显著的促进乳蛋白基因的表达，P-Met-Met、P-Met-Trp、P-Met-Phe和P-Met-Lys的促进效果较好，其中尤以P-Met-Met的效果最好。

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