松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5-1A过氧化物酶的研究

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松材线虫病(Pine wilt disease，PWD)主要通过松褐天牛为宿主传播，是由松褐天牛携带的松材线虫(Bursaphelenchus xyluphilus)引起的一种松树毁灭性传染疾病。PwD可以对多种松属的植物造成危害。由于松材线虫病的发生和发展过程中涉及到松树寄主、媒介昆虫、松材线虫、相关的微生物以及环境条件等多种因素，而这些因素之间构成了复杂的关系，所以给该病的致病机理研究以及防治工作造成了难度。本实验研究了松材线虫携带的荧光假单胞菌GcM5-1A的培养液经硫酸铵分级沉淀后各组分中木质素过氧化物酶(LiP)的活性及各组分对黑松悬浮细胞的毒性。本文还对GcM5-1A菌株胞外LiP进行了初步纯化，并对纯化后的酶学性质进行了研究。结果表明：LiP活性主要出现在50％-70％沉淀组分中；除了0-20％沉淀组分，50-70％沉淀组分对黑松悬浮细胞的毒性也很强。GcMS-IA菌株培养液经硫酸铵分级沉淀以及DEAE-Sepharose FF两步纯化后，其LiP的比活力从0.81U/mg提高到21.30 U/mg。其最适温度为35℃，最适pH为4.0。在15-35℃、pH6.0-9.O范围内，酶活保持相对稳定。NH20H.HC1和KCN对酶活的抑制作用分别达到88％和57％，而NaN3对酶活的抑制作用只有15％左右。吸收光谱显示该酶在406 nm处有一个Soret峰，加入1mmol/L Na2S204后，吸光度出现了明显的下降，但Sorer峰没有显著移动。
　　另外，我们构建了荧光假单胞菌GcM5-1A菌株的基因组文库，并且通过生物活性测定的方法从文库中筛选出一个产毒素的转化子。我们对核苷酸序列进行了测定，结果表明该序列含一个1290 bp的开放读框。信号分析软件推测N末端有一个36个氨基酸的信号肽。同源性分析显示，毒素基因的核苷酸序列与P.f1uorescensSBW25的PFLU2919基因，P.fluorescens Pf-5的Dyp类型过氧化物酶家族基因以及P.fluorescens PfO-1的Tat转移酶分别有83％，82％和80％的相似性。我们分别克隆了编码全长蛋白的基因和去掉信号肽的基因，并在E.coli BL21中进行了可溶性表达、探索了目的蛋白最适诱导表达条件。通过Ni2+亲和层析的方法得到了纯化的全长以及去掉信号肽的重组蛋白。生测结果表明全长以及去掉信号肽的重组蛋白都对黑松的悬浮细胞显示了毒性。HPLC分析显示，加入全长重组蛋白和过氧化氢的黑松松枝提取物组分发生了明显的变化，这说明此种毒素蛋白可能是一种过氧化物酶。

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作者
孔令营;
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作者单位

青岛大学;

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授予单位青岛大学;
学科微生物学
授予学位硕士
导师姓名李荣贵;
年度 2010
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类植物病理学;各种树的病虫害及其防治;
关键词
松材线虫病; 荧光假单胞菌GcM5-1A; 木质素过氧化物酶; 过氧化物酶; 基因克隆;

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