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亚油酸对赤潮异弯藻和东海原甲藻的克生效应及细胞凋亡机制的研究

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从20世纪60年代起赤潮现象开始在全球蔓延，至今已成为世界性的海洋灾害之一。赤潮在世界沿海区域频繁发生，对公众健康、海洋环境、水产养殖业及自然资源产生显著不良影响。面对海洋赤潮问题的复杂性以及赤潮灾难的严重性，积极研究并采取切实可行的赤潮防治措施迫在眉睫。大量研究表明，利用大型海藻分泌的不饱和脂肪酸对赤潮微藻产生克生效应是一种环境友好、可持续性强的生物防治方法。本论文采用实验生态学方法，选取两种具有代表性的优势赤潮藻种赤潮异弯藻（Heterosigma akashiwo）和东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）作为研究对象，在本课题组已经筛选出三种抑藻效果最好的不饱和脂肪酸前提下，选取其中一种不饱和脂肪酸亚油酸作为克生物质，研究亚油酸对赤潮异弯藻和东海原甲藻的克生效应及细胞凋亡机制的影响。本研究为利用大型海藻有效控制有害藻华的实施提供实践科学依据，具有重要的理论意义和应用前景。结果如下：
　　1.利用不同浓度的亚油酸作用48h，初步研究亚油酸对赤潮异弯藻和东海原甲藻的克生作用，结果表明：随亚油酸浓度梯度的增大，微藻生长量呈现先升高后下降的趋势，两种微藻的抑制率呈现与生长量变化相对应的先降后升趋势。当亚油酸浓度为900μg/L时，赤潮异弯藻的抑制率为97.3％，东海原甲藻的抑制率为91.8％，亚油酸对两种微藻的抑制效果显著（P<0.05）。
　　2.通过不同浓度的亚油酸作用于赤潮异弯藻和东海原甲藻48h后检测抗氧化系统、活性氧水平以及膜脂过氧化水平，结果表明：随亚油酸浓度的增大，细胞内抗氧化酶类的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性以及抗氧化非酶类的抗坏血酸（Vc）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量呈现出低浓度促进高浓度抑制的趋势；总ROS和超氧阴离子自由基（O2-·）水平呈现出先升高后降低的趋势，过氧化氢（H2O2）以及羟自由基（·OH）水平整体呈现不断上升趋势；丙二醛（MDA）含量随亚油酸浓度的增大呈现为持续上升趋势。
　　3.在亚油酸作用下，从细胞形态、生化以及分子生物水平，通过台盼蓝染色、透射电镜、细胞流式及荧光检测技术等方法研究微藻细胞凋亡机制，结果表明：
　　（1）随亚油酸浓度的升高，赤潮异弯藻和东海原甲藻未染色细胞数目呈现出先升后降的趋势。当亚油酸达到最大浓度900μg/L时，赤潮异弯藻未染色细胞数目降低了85.9％，东海原甲藻降低了91.3％，与对照组相比差异显著（P<0.05）。
　　（2）赤潮异弯藻和东海原甲藻在亚油酸作用下的细胞超微结构检测结果显示：赤潮异弯藻细胞外形变小且不规整，细胞质收缩，部分细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜界限不清甚至已经消失，只剩残片。东海原甲藻细胞出现质壁分离现象，细胞壁以及液泡膜出现断裂，细胞出现空洞。叶绿体出现明显膨胀，且类囊体垛叠而成的基粒出现松散甚至消失。
　　（3）利用带有绿色荧光的荧光探针FITC标记的Annexin V来检测细胞凋亡时出现在细胞膜表面的磷酯酰丝氨酸，结果显示：亚油酸处理组的赤潮异弯藻和东海原甲藻细胞均出现不同时期的凋亡状态。
　　（4）亚油酸作用下，赤潮异弯藻和东海原甲藻通过JC-1荧光探针在细胞中由红色荧光转变为绿色荧光而显示出线粒体膜电位下降，利用酶标仪检测显示Caspase-3,9酶活性及Cyt-C释放量显著升高，Bcl-2抗凋亡蛋白表达量降低。

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