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组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA诱发人肺腺癌细胞株A549侵袭转移的机制研究

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前言

1．肺癌与转移

2．组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)

3．上皮-间质转化(EMT)

3．1EMT与肿瘤侵袭转移

3．2肿瘤细胞发生EMT的分子机制

4．本研究的意义

第一部分SAHA诱导A549细胞发生EMT转化的作用研究

1．材料

1．1．细胞株

1．2．引物

1．3．试剂及耗材

1．4．仪器设备

1．5．主要溶液配制

2．实验方法

2．1．细胞培养及加药

2．2．CCK8实验

2．3．细胞划痕实验

2．4．Transwell侵袭实验

2．5．蛋白免疫印迹(Western Blotting)

2．6．荧光定量PCR

2．7．免疫荧光

2．8．数据统计分析

3．实验结果

3．1．SAHA处理对A549细胞存活率的影响

3．2．SAHA引起A549细胞发生EMT样形态变化

3．3．SAHA可诱导A549细胞EMT标志物的表达变化

3．4．SAHA促进A549细胞的迁移侵袭能力

4．讨论

第二部分SAHA诱导A549细胞发生EMT转化的分子机制研究

1．4．抗体

1．5．试剂及耗材

1．6仪器

1．7溶液配制

2． 实验方法

2．1．细胞培养

2．2 Transwell侵袭实验

2．3蛋白免疫印迹(Western Blotting)

2．4荧光定量PCR

2．5 RNA干扰实验

2．6激光共聚焦检测Slug入核

2．7试剂盒分离细胞核和细胞浆蛋白

2．8免疫共沉淀实验

2．9数据分析

3．实验结果

3．1．SAHA引起EMT转录因子Slug表达上调

3．2．干扰Slug可阻断SAHA诱导的EMT转化

3．3．干扰Slug抑制了SAHA引起的A549细胞侵袭转移能力

3．4．SARA促进Slug发生核转位

3．5．SAHA促进Slug蛋白乙酰化

4．讨论

第三部分过表达Slug促进A549细胞恶性表型的作用研究

1．材料

1．1．细胞株

1．2．引物

1．3．抗体

1．4．其他试剂及耗材

1．5．仪器

1．6．溶液配制

2．实验方法

2．1．细胞培养

2．2．Western Blotting

2．4．细胞转染实验

2．5．Transwell侵袭实验

2．6．微球形成实验

2．7．CCK8实验

2．8．数据分析

3．实验结果

3．1．过表达Slug促进A549细胞获得EMT表型

3．2．过表达Slug促进A549细胞的迁移侵袭能力

3．3．A549／CDDP细胞获得肿瘤相关干细胞表型

3．4．过表达Slug促进A549细胞对顺铂的耐药性

4．讨论

结语

参考文献

第四部分 综述

发表文章列表

致谢

外文论文

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摘要

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一，近年来，肺癌发病率和死亡率增长速度越来越快，肺癌在男性恶性肿瘤中的发病率和死亡率已经上升到第一位，在女性中的发病率和死亡率也已经上升到第二位，肺癌已经成为威胁人类健康和生命的最常见的恶性肿瘤。同时，随着人类的进步，科技的发展，医疗水平的不断提高，各种疾病的诊断及治疗方法也随着不断的改进，针对肺癌的治疗方法及手段也越来越多，如手术、放疗、化疗、中医、免疫治疗等，肺癌的治疗效果较之前也有所改善。但相对于其它恶性肿瘤，肺癌的总体治疗效果仍然较差，特别是肺癌中占绝大多数的非小细胞肺癌(NSCLC)。近年来，虽然肺癌的发病率逐渐上升，但总体死亡率却有所下降。根据2018年最新的研究数据显示，非小细胞肺癌5年的生存率为19.8％，这个数据较早些年已经有所提高了，但仍然不能令广大学者们满意。研究其中原因，由于仍然缺乏有效的早期诊断方法，75％的非小细胞肺癌患者确诊时已有远处转移而失去最佳治疗时机。广大研究学者认为侵袭转移既是各种恶性肿瘤的标志和特征，也是许多恶性肿瘤治疗效果差的主要原因，同样也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因。因此肺癌患者是否发生转移的早期判断以及抑制肺癌细胞的侵袭转移对于其治疗和预后有至关重要的临床意义。 早年的研究者通过多年的实验研究提出了上皮-间质转化(EMT，Epithelial-MesenchymalTransition)概念，是指上皮细胞向间质细胞转化的现象。EMT的最重要特征就是具有极性的上皮细胞失去上皮表型而获得间质表型，其中各种上皮型标志物表达下降，间质型标志物表达升高;同时，细胞的形态也由椭圆多边形变为梭长的纤维形。EMT转化最初是在胚胎形成阶段被发现的，后来研究逐渐发现EMT可以发生在组织炎症、组织修复及器官形成等各种机体反应中，近年来的研究通过发现胚胎发育与肿瘤转移过程之间存在高度的相似性，使得人们对肿瘤形成及恶性转化的过程有了更深入的了解，对EMT的研究重心也逐渐从胚胎阶段、各种机体反应，逐步扩展至肿瘤领域。研究发现肿瘤细胞通过EMT转化，获得更强的迁移能力，穿越细胞基底膜和外基质形成侵袭转移，同时在这一转化过程中，细胞获得了免疫抑制和抵抗凋亡的能力而侵袭能力变强。 EMT是肿瘤细胞发生侵袭和转移的关键起始步骤，发生EMT后，肿瘤细胞的侵袭转移随着开始发生发展，EMT也是肿瘤细胞发生侵袭转移的重要潜在机制。作为EMT重要的转录因子Slug在整个EMT过程中发挥着调控作用，作为锌指转录因子家族重要成员之一的Slug基因自身结构中的锌指结构对于其发挥调控作用至关重要，锌指结构可以通过结合E-cadherin基因启动子上的E-box碱基序列(5'-CAGGTG-3')，抑制E-cadherin基因启动子的活性，从而抑制该基因表达。多种细胞外信号和细胞内信号通路都可以刺激S1ug的表达，并促进其从细胞质转位到细胞核，在细胞核内发挥调控作用。此外，Slug在多种肿瘤组织中呈现高表达的状态，包括肺癌、乳腺癌等，其表达水平也与肿瘤复发和治疗预后存在密切关系。随着研究的深入，不断有研究报道，Slug的作用不仅仅在于调控各种类型肿瘤细胞EMT转化和侵袭转移，Slug还在肿瘤发生发展的进程中发挥着其他生物学功能，如Slug可以诱导肿瘤细胞获得肿瘤相关干细胞特性，如Slug可以增强肿瘤细胞对抗化疗药物的耐药性等。随着研究学者不断发现Slug在肿瘤的侵袭转移中的诸多调控作用以及Slug其它生物学重要作用，Slug也逐渐被广大学者们视为肿瘤发生发展过程中的重要研究靶点。从国内外范围来看，对于Slug在肿瘤中的作用研究尚处于起步阶段，其潜在调控机制并不明确，有关Slug在介导EMT之外的肿瘤细胞恶性转化方面的研究则更为少见。 组蛋白乙酰化酶(Histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase，HDAC)是机体内转录调控过程中发挥重要作用的两类酶，这两类酶在体内维持稳定水平，他们共同调控着组蛋白的乙酰化状态，两种酶的表达和功能相互制约，并达到一种动态平衡。当外界环境或者外来因素改变时，这种平衡就有可能被彻底打破，随之出现乙酰化状态的失衡，从而导致肿瘤的发生发展。 组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitors，HDACIs)是一类新型的、具有靶向选择性的、强效的抗肿瘤药物，是以目前药物研究领域的热门组蛋白乙酰化酶为靶点而设计的。HDACIs主要是通过促进组蛋白乙酰化，激活抑癌基因，从而抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤细胞凋亡。因为HDACIs有着强效的抗肿瘤效果，HDACIs也已经成为药物研究领域的热点之一。随着研究的不断深入，越来越多的HDACIs进入临床研究阶段，应用前景非常广泛。在多种HDACIs中，氧酸类的沃雷诺司(vorinostat，SAHA)是第一个被美国食品药品管理局批准用于治疗皮肤T细胞淋巴瘤的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，目前已经用于乳腺癌、白血病以及结直肠癌等的治疗。此外，SAHA与其他抗肿瘤药物联合应用也有良好的效果。然而，SAHA针对上皮来源的肿瘤的疗效却不太理想，而其中的潜在机制也并不明确。针对HDACIs的研究亟待开展，只有研究学者们发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂的更多的作用机理，才能够为广大临床工作者在临床上合理的使用治疗更多恶性肿瘤来提供理论依据。因此，本研究为了证明临床中选择使用HDACIs进行肺腺癌治疗时，是否存在增加肺腺癌细胞扩散及转移的风险，我们选择人肺腺癌细胞株A549作为实验对象，选用组蛋白去乙酰化酶抑制剂中SAHA作用A549细胞，通过本研究中的多项实验研究，努力发现SAHA是否能促进A549细胞发生侵袭转移？如能SAHA能增加A549细胞侵袭转移能力，其潜在机制又是如何？ 研究目的: 研究SAHA诱导A549细胞发生EMT转化并促进A549细胞侵袭转移的生物学作用，系统而深入的探讨Slug在SAHA介导的EMT转化中的作用以及SAHA调控因子Slug的潜在分子机制;进一步研究Slug过表达对A549细胞恶性进展的影响，从而为以Slug为靶标的抗肿瘤治疗提供理论和实验依据。 研究方法: 本研究所使用的研究方法包括:人肺腺癌细胞株A549、细胞划痕实验、Transwell侵袭实验、微球形成实验、基因转染与敲除、荧光定量PCR、免疫荧光、激光共聚焦、蛋白免疫印迹、免疫共沉淀、CCK8实验等。 研究的主要内容包括: 1.SAHA诱导A549细胞发生EMT转化的作用研究。观察EMT相关分子标志物的表达变化，监测SAHA对A549细胞侵袭转移能力的影响。 2.SAHA诱导A549细胞发生EMT转化的分子机制研究。 3.过表达Slug促进A549细胞恶性表型的作用研究。 研究结果: 1.研究发现SAHA能够提高A549细胞的侵袭转移能力。并发现SAHA能够诱导A549细胞发生EMT样形态改变，抑制上皮型标志物E-cadherin的表达，促进间质型标志物Vimentin的表达，从而促进EMT的发生。 2.研究发现SAHA可以以时间依懒性的方式促进EMT重要调控蛋白Slug的基因和蛋白表达，并发现SAHA可以诱导Slug蛋白发生核转位，增强其在细胞核中的表达，利用基因敲除技术干扰Slug的表达能够逆转SAHA诱导的EMT，抑制了SAHA引起的侵袭转移能力。 3.研究发现SAHA对调控Slug稳定性的关键激酶GSK-3β的活性没有明显影响，而是通过促进Slug的乙酰化，从而增强Slug的表达，促进Slug发生核转位，最终诱导A549细胞发生EMT转化。 4.研究发现过表达Slug能够促进A549细胞的侵袭转移能力，并抑制E-cadherin的表达，促进Vimentin的表达，促进A549细胞发生EMT转化。 5.发现过表达Slug可以促进A549细胞中肿瘤相关干细胞标志物Nanog和BMI-1的表达，并且增加了A549细胞的微球形成能力的获得，促进A549细胞的肿瘤干细胞特性和对顺铂的耐药性。 研究结论: 1.发现SAHA能诱导A549细胞发生EMT，并提高A549细胞的侵袭转移能力。该研究提示在临床中使用SAHA治疗肺腺癌时，存在肺腺癌细胞侵袭转移的风险。 2.发现SAHA诱导A549细胞发生EMT的机制是通过促进了关键转录因子Slug的乙酰化，从而促进其表达。该研究为研制以Slug为靶标的药物治疗肺腺癌提供重要的理论依据和实验基础。 3.发现Slug过表达能够促进A549细胞的侵袭转移能力和EMT转化，并发现Slug过表达能够促进A549细胞肿瘤干细胞特性和对顺铂的耐药性。该研究进一步为以Slug为靶点的药物治疗肺腺癌提供重要的临床依据。

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