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蛋白质代谢关键调控分子GCN2在幽门螺杆菌诱导的胃癌发生中的作用及与细胞自噬的关系

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摘要

符号说明

前言

实验材料

1．细胞培养、传代及冻存

3．细胞内总RNA提取

4．反转录及实时荧光定量PCR

5．蛋白免疫印迹

6．免疫组化

8．质粒抽提

9．实验用裸鼠

10．其他实验常用仪器

实验方法

1．细胞培养

2．临床标本收集

3．免疫组织化学染色

4．免疫蛋白印迹(Western blotting)

5．克隆形成实验

6．透射电镜

7．细胞内总RNA提取

8．反转录及荧光定量PCR

9．幽门螺杆菌感染及脂多糖LPS刺激

10．质粒提取

11．动物实验

12．统计学分析

实验结果

一．细胞水平

二．实验动物模型水平

三．人体胃癌病理组织标本水平

讨论

结论

附录

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文

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摘要

研究背景
　　幽门螺旋杆菌（H.Pylori）作为世界卫生组织确定的Ⅰ类致癌物，在胃癌发生中起重要作用。细胞自噬在肿瘤发生发展中的重要性日益受到关注，但其在幽门螺杆菌感染导致的胃癌发生中的作用机制并不明确。真核翻译起始因子2α亚单位(eIF2α)激酶GCN2(general control nonderepressible-2)是蛋白质代谢过程中关键的调节因子，能够参与细胞应激、代谢、自噬、炎症等多种反应，并已被初步证实在肺癌、结肠癌、乳腺癌等疾病的发生发展中起重要作用，但其在幽门螺杆菌感染导致的恶性变中的作用研究较少。因此，研究幽门螺杆菌是否通过调控GCN2影响自噬过程中的重要调节因子如Beclin1(BECN1)的表达，参与自噬体的形成和成熟从而导致胃癌细胞自噬发生及相关分子作用机制，对于更好地理解幽门螺杆菌感染与胃癌发生的相关性十分必要。
　　研究目的：
　　1.研究在胃癌发生过程中，幽门螺杆菌对GCN2表达的调控作用;
　　2.探究在胃癌细胞自噬中，GCN2的作用以及相关分子调控机制。
　　研究方法：
　　1.细胞分子水平
　　通过Western blot和qRT-PCR法检测四种胃粘膜上皮细胞来源的永生化细胞系GES-1及胃癌细胞系AGS，BGC-823和SGC-7901中GCN2的本底表达情况。胃癌细胞感染幽门螺杆菌或通过脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激后，利用Western blot法检测GCN2及BECN1的表达变化;回复实验验证LPS是否能够通过GCN2影响胃癌细胞自噬;透射电镜观察细胞自噬小体的形成情况。转染GCN2的特异小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)后通过Western blot检测BECN1的表达变化;克隆形成实验验证GCN2对胃癌细胞增殖能力的影响。通过回复实验验证GCN2通过转录激活因子4(ATF4)途径调控BECN1的可能性。
　　2.动物水平
　　进行裸鼠皮下成瘤，观察肿瘤生长情况，测量肿瘤大小。通过Western blot，qRT-PCR，免疫组化和透射电镜观察，检测GCN2在胃癌发生中的作用及调控细胞自噬的作用机制。
　　3.人体胃癌组织病理标本水平
　　通过免疫组化实验检测12对人体胃癌组织及癌旁正常组织标本中GCN2及BECN1的表达情况，并结合生物信息学数据进一步分析GCN2和BECN1在胃癌发生中表达的相关性及与疾病预后的关系。
　　研究结果：
　　1.细胞分子水平
　　GCN2在四种胃粘膜上皮细胞来源的永生化细胞株及胃癌细胞系中均稳定表达。幽门螺杆菌感染及LPS刺激后，GCN2和BECN1的表达均升高，并与作用时间及浓度呈一定的正相关性。回复实验证实LPS能够通过GCN2影响胃癌细胞自噬蛋白的表达和自噬小体的生成。在胃癌细胞系中特异性抑制GCN2表达可使ATF4和BECN1表达同步降低，从而抑制胃癌细胞的增殖能力。GCN2可通过ATF4途径调控BECN1的表达从而影响胃癌细胞自噬。
　　2.动物水平
　　敲除GCN2基因后，裸鼠皮下种植瘤的生长受到抑制，自噬相关蛋白表达也同时下降，细胞自噬小体形成减少。
　　3.人体胃癌组织病理标本水平
　　结合免疫组化检测及生物信息学数据分析，GCN2在12对人体胃癌组织病理标本中显著高表达;自噬相关蛋白BECN1在胃癌中同时高表达，与GCN2的表达具有正相关性。GCN2的表达情况与胃癌病人的预后具有相关性。
　　研究结论：
　　GCN2在人体胃癌组织中高表达;幽门螺杆菌可通过GCN2调控细胞自噬相关蛋白表达，促进细胞自噬，参与胃癌发生。此研究初步探讨了GCN2在幽门螺杆菌诱导的胃癌发生中的重要作用及相关分子调控调控，为胃癌的早期预防和治疗提供了一定的新理论依据。

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