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p53和BRCA1在辐射诱导的DNA双链断裂损伤修复中功能相关性的研究

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摘要

符号说明

前言

1 HR修复机制

2 乳腺癌易感基因BRCA1与HR

3 肿瘤抑制因子p53与HR

4 p53和BRCA1的功能关联性

材料与方法

细胞株

主要试剂和仪器

电离辐射(Ionizing radiation，IR)条件

细胞培养、传代、冻存与复苏

质粒的扩增与提取

BRCA1和p53 shRNA慢病毒包装和转染

慢病毒转导

shRNA表达下调实验和HA-wtp53恢复实验

MCF7／E6和MCF7／LXSN细胞系的建立

表达pDR-GFP同源重组底物的MCF7／pDR-GFP细胞系的建立

蛋白免疫印迹法

免疫共沉淀实验

HR修复效率的测定

免疫荧光实验

克隆形成实验

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)

细胞周期的检测

统计学分析

实验结果

1．应答DNA损伤时，p53抑制过度重组

2．p53抑制Rad51在DM损伤位区域过度募集

3．p53通过调节BRCA1活性以调控HR修复机制

4．在BRCA1表达缺欠细胞中，p53表达下调后可恢复HR效率

5．p53与BRCA1功能相关性对细胞的辐射抵抗性的影响

6．p53与BRGA1功能相关性对染色体结构稳定性的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文目录和成果

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摘要

研究目的：
　　各种外源性因素例如电离辐射(ionizing radiation，IR)、紫外线及化疗药物和内源性因素例如代谢产物及活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)等均可造成DNA不同形式的损伤，诸如复制叉停滞、DNA单链断裂和DNA双链断裂等(double strands breaks，DSBs)。DSBs是DNA最严重的损伤形式之一，它可导致染色体重排、肿瘤的发生和细胞死亡等。在应答DNA损伤时，有两种主要机制参与DNA DSBs修复:同源重组(homologous recombination，HR)和非同源末端链接(non-homologous end joining，NHEJ)。
　　乳腺癌易感基因1（breast cancer susceptibility gene1,BRCA1）是调控HR修复DSBs的重要蛋白。p53作为重要的肿瘤抑制因子也参与包括细胞周期停滞、细胞凋亡、转录调控和DNA损伤修复等一系列细胞活动。相关研究表明，p53和BRCA1都参与细胞增殖和DNA修复过程中转录调控，但是两种蛋白在IR致DNA DSBs修复中的相互作用，尤其是在协同调控HR修复的分子机制中的作用目前仍不清楚。
　　本课题通过乳腺癌肿瘤细胞中p53和BRCA1功能状态对细胞DSBs修复、放射敏感性和维持细胞基因稳定性等方面作用的研究，以探讨p53和BRCA1功能关联性在调控HR修复过程中的作用。p53和BRCA1功能关联性在HR分子机制中作用的阐明，对揭示HR修复的分子机制及肿瘤的发生都将具有重要的意义。
　　研究方法：
　　1.细胞系工作模型的建立
　　应用HPV-E6和LXSN逆转录病毒颗粒感染含有野生型p53(wild type p53,wtp53)MCF7细胞，建立p53表达下调的MCF7/E6和表达wtp53的MCF7/LXSN同源配对细胞系;用pLKO-1和p53shRNA病毒颗粒感染MCF7细胞建立p53表达下调的同源配对细胞系;转染HR底物报告基因pDR-GFP至MCF7细胞，建立表达pDR-GFP的MCF7/pDR-GFP细胞系。
　　2.p53和BRCA1表达的检测
　　分别用HPV-E6病毒感染wtp53的MCF7细胞降解p53,或者用shRNA沉默MCF7细胞中p53表达，无IR或给予10Gy电离辐射后8h，用RT-qPCR法检测p53和BRCA1的mRNA水平变化，用蛋白免疫印迹法观察p53、BRCA1、p21等蛋白的表达情况，用免疫荧光法观察BRCA1、Rad51等蛋白焦点形成的动态变化。用shRNA沉默MCF7细胞中BRCA1表达，无IR或给予10Gy电离辐射后8h，通过蛋白免疫印迹法观察p53、BRCA1等蛋白的表达情况。
　　3.p53和BRCA1蛋白水平相互作用的测定
　　转染wtp53进入H1299细胞，通过免疫共沉淀实验观察p53和BRCA1在蛋白水平上的相互作用。
　　4.HR修复效率的测定
　　用HPV-E6病毒感染MCF7/pDR-GFP细胞降解p53、或用shRNA沉默MCF7/pDR-GFP细胞中p53的表达以及下调p53后再转染wtp53以恢复p53的表达，在上述不同条件下通过流式细胞术测定自发HR(spontaneous homologousrecombination，SR)效率和核酸酶Ⅰ-SceⅠ诱导的HR效率。
　　5.细胞周期的检测
　　HPV-E6病毒感染MCF7细胞、或用p53的shRNA沉默MCF7细胞中p53表达、以及下调p53后再转染wtp53以恢复p53表达，然后在无IR或给予10Gy电离辐射后，收集细胞，0.1％ TritonⅩ-100处理、冰乙醇固定和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色后，通过流式细胞术检测细胞周期。
　　6.应用克隆形成实验检测细胞放射敏感性
　　分别用HPV-E6病毒或者BRCA1的shRNA作用于对数生长期的MCF7细胞，分别给予0、2、4和6Gy不同剂量电离辐射照射，继续培养三周，甲醇固定和结晶紫染色后，计数细胞克隆形成数，并计算克隆形成数。
　　7.应用荧光原位杂交实验检测细胞染色体稳定性
　　分别用HPV-E6病毒或者BRCA1的shRNA作用于MCF7细胞，给予0Gy或2Gy电离辐射照射后24小时，应用肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)探针通过荧光原位杂交实验(fluorescence in situ hybridization，FISH)检测细胞染色单体和染色体断裂、及辐射状染色体异常结构形成。
　　研究结果：
　　1.成功建立细胞系工作模型
　　蛋白免疫印迹法结果显示，含HPV-E6或p53.shRNA病毒颗粒感染MCF7细胞后，与对照组细胞系中p53表达相比，MCF7/E6和p53shRNA细胞系中p53和p21表达量明显降低;用转染wtp53方法恢复p53的表达，p53诱导的p21表达量又有所增加，提示成功建立了两对p53缺欠同源配对细胞系。流式细胞术结果显示，也成功筛选出表达同源重组底物pDR-GFP的MCF7细胞，建立MCF7/pDR-GFP细胞系。
　　2.应答DNA损伤时，p53抑制过度重组修复
　　流式细胞术检测HR的结果显示，应用HPV-E6和p53的shRNA分别降解和沉默MCF7/pDR-GFP细胞系中的p53表达后，与对照组相比，SR效率和Ⅰ-SceⅠ诱导的HR效率都进一步显著增加(p＜0.01);当p53缺欠的MCF7细胞被转染表达wtp53质粒后，Ⅰ-SceⅠ诱导增加的HR效率又发生明显的降低(p＜0.01)。
　　3.p53抑制DNA损伤位点Rad51的过度募集
　　免疫荧光实验结果显示，HPV-E6感染MCF7细胞后，未给予IR照射时，Rad51蛋白焦点形成细胞百分比从5.3％显著增加至21.9％(p＜0.05);10Gy电离辐射照射后8h，IR诱导的Rad51蛋白焦点形成细胞百分比从45.7％进一步显著增加至71.0％(p＜0.05)。10Gy电离辐射照射后8h内各时间点，与对照组比较，shRNA沉默p53表达后Rad51蛋白焦点形成的细胞百分比都相应地显著增加。
　　4.p53通过调节BRCA1活性以调控HR修复分子机制
　　蛋白免疫印迹法结果显示，BRCA1的shRNA可成功下调BRCA1在MCF7细胞系中的表达，p53的表达量并未受到影响。但是，下调MCF7细胞中p53表达后BRCA1表达量显著增加，若进一步恢复wtp53在细胞中的表达，增高的BRCA1的表达量又被降低;同样，恢复wtp53在H1299细胞中的表达后，细胞中BRCA1表达量明显降低。以上实验研究提示在蛋白水平上p53能够抑制BRCA1过度表达。
　　免疫荧光实验结果进一步显示，HPV-E6感染MCF7细胞后，未给予IR时，BRCA1蛋白焦点形成细胞百分比从31.4％显著增加至50.8％(p＜0.05);10Gy电离辐射照射后8h，IR诱导的BRCA1蛋白焦点形成细胞百分比从51.4％也进一步显著增加至78.6％(p＜0.05)。shRNA沉默p53表达后10Gy电离辐射照射后8h内各时间点与对照比较，BRCA1蛋白焦点形成的细胞百分比均相应地显著增加(p＜0.05)。以上实验研究提示p53能够抑制BRCA1在DNA损伤区域的过度募集。
　　免疫共沉淀实验结果显示，p53和BRCA1两种蛋白之间有相互作用，并且存在于同一蛋白质复合物沉淀中。
　　RT-qPCR实验结果显示，shRNA沉默MCF7细胞中p53表达后，BRCA1的mRNA水平显著升高(p＜0.01)，再恢复wtp53表达后，增高的BRCA1的mRNA水平表达又明显降低(p＜0.01)。以上实验研究提示在转录水平上p53可抑制BRCA1mRNA表达。
　　5.在BRCA1表达缺欠细胞中，p53表达下调还能恢复HR效率
　　细胞流式细胞术结果显示，在BRCA1表达正常细胞中，HPV-E6降解p53后，细胞SR效率和Ⅰ-SceⅠ诱导的HR效率分别增加了2倍和5倍(p＜0.01);在BRCA1表达缺欠细胞中，再下调p53表达后，降低的HR又得以恢复。
　　6.p53与BRCA1功能相关性对细胞的辐射抵抗性的影响
　　克隆形成实验结果显示，在2、4和6Gy电离辐射处理MCF7细胞后，与正常对照组相比较，用HPV-E6病毒下调p53表达可显著增加细胞对辐射的抵抗性(p＜0.01);用BRCA1 shRNA下调BRCA1表达则可增加细胞对辐射的敏感性(p＜0.01)。在BRCA1表达缺欠细胞中，进一步灭活p53功能，发现2Gy和4Gy电离辐射照射细胞后，细胞对辐射抵抗性又增强，使对辐射敏感的细胞又变得不敏感(p＜0.01)，但6Gy处理组细胞的敏感性没有明显变化(p＞0.05)。
　　7.p53与BRCA1功能相关性对染色体稳定性的影响
　　FISH结果显示，当未给予IR时，p53表达缺欠的MCF7细胞中自发性的染色单体断裂、染色体断裂和辐射状染色体异常结构形成等无明显变化(p＞0.01)，但是，BRCA1表达缺欠细胞中的染色体断裂和辐射状染色体异常结构形成显著增加(p＜0.01)。IR照射细胞后，p53表达下调使IR诱导的染色体断裂和辐射状染色体异常结构形成明显减少，而BRCA1缺欠则使染色体异常结构形成明显增多;但在BRCA1表达缺欠的细胞中，进一步下调p53表达后，自发和IR诱导的染色单体断裂、染色体断裂和辐射状染色体异常结构形成均有所减少。该项指标变化与HR效率、细胞对辐射敏感性等结果相一致。
　　研究结论：
　　1.p53可抑制Rad51介导的过度重组修复。
　　2.p53可在转录水平上抑制BRCA1功能过强，在调控HR的分子机制中p53和BRCA1之间存在功能关联性。
　　3.p53与BRCA1功能相关性可影响细胞辐射抵抗性和染色体稳定性。
　　4.p53还可不依赖于BRCA1通路抑制HR修复分子机制。

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