可溶性鸟苷酸环化酶激活剂cinaciguat对高糖状态下人脐静脉内皮细胞的影响

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糖尿病血管病变因其较高的发生率、致残率以及致死率成为糖尿病最主要的并发症之一。内皮功能损伤是糖尿病血管病变的始动环节和关键。高糖可通过多种机制损伤内皮功能，如氧化应激、炎症反应等。一氧化氮(NO)作为一种信号转导分子，能够通过NO/可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)/环磷酸鸟苷(cGMP)信号途径发挥血管舒张、抗炎、抗氧化的作用。病理情况下，NO与sGC均被氧化，使此信号通路无法正常进行。Cinaciguat（以下简称CIN）是一种新发现的sGC激活剂，其既不依赖NO又可激活被氧化的sGC，从而激活上述通路发挥抗炎、抗氧化的特性。有研究表明其对心肌梗死、心肌缺血或再灌注损伤、氧化应激引起的内皮功能紊乱、新生血管内膜形成、以及心肌肥大等均有改善作用。但CIN在糖尿病血管病变的发病过程中的作用尚不明确。因此本研究选择高糖诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型，模拟糖尿病的体内环境，探索CIN对糖尿病血管内皮细胞的保护作用。
　　目的:
　　观察CIN对高糖环境下人脐静脉内皮细胞一氧化氮(NO)、氧化应激相关指标以及炎症相关指标的影响，评价其对糖尿病血管内皮细胞的保护作用，并初步探讨其作用机制，为糖尿病血管病变的靶向治疗提供理论依据。
　　方法:
　　1.细胞来源及培养:购买的人脐静脉内皮细胞株置于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，放入37℃、5％的CO2培养箱中培养。
　　2.高糖损伤模型的建立:根据预实验结果，采用葡萄糖浓度为33.3mmol/L作用于体外培养的HUVECs细胞48h建立高糖损伤模型。
　　3.CIN对细胞增殖活性的影响:HUVECs细胞生长至70％-80％融合时，高糖(33.3mmol/L)孵育48h诱导损伤，用CIN（0.01、0.1、1和10μmol/L）处理细胞48h，MTT法测细胞存活率。
　　4.实验分组:HUVECs细胞生长至70％-80％融合时，将HUVECs随机分为4组:①正常组(葡萄糖浓度为5.5mmol/L);②正常组+CIN组（葡萄糖浓度为5.5mmol/L+CIN浓度为1μmol/L）;③高糖组（葡萄糖浓度33.3mmol/L）;④高糖组+ CIN组（葡萄糖浓度为33.3mmol/L+CIN浓度为1μmol/L）。处理48h用于后续实验。
　　5.采用硝酸还原酶法测NO水平。
　　6.氧化应激相关指标的检测:利用荧光探针DCFH-DA检测ROS，采用硫代巴比妥酯法、黄嘌呤氧化酶法检测MDA、SOD的含量。
　　7.采用实时荧光定量聚合酶链反应法(RT-PCR)检测ICAM-1、VCAM-1的mRNA表达水平。
　　8.采用免疫印迹法检测ICAM-1、VCAM-1、NF-κ Bp65的蛋白表达水平。
　　结果:
　　1.细胞存活率的检测:与正常组相比，高糖组细胞存活率降为(40.7±10.1)％，与正常组相比下降了59.3％(P＜0.01)。与高糖组相比，高糖+CIN（0.01、0.1、1、10μmol/L）各组的细胞活性增加为(60.0±13.6)％，(79.1±11.6)％，(93.1±9.1)％、(93.4±9.3)％，与正常组相比增加了40％、20.9％、6.9％、6.6％（均P＜0.05）。但CIN1μmol/L与CIN10μmol/L相比细胞活性无明显差别（P＞0.05）。
　　2.NO的生成量:与正常组相比，高糖组NO生成量明显减少(18.26±2.03μmol/L vs12.78±0.92μmol/L，P=0.000)。与高糖组相比，高糖组+CIN组NO生成量明显增加(12.78±0.92μmol/L vs17.24±1.69μmol/L，P=0.001)。与正常组相比，正常组+CIN组NO生成量无显著差异（P＞0.05）。
　　3.氧化应激:与正常组相比，高糖组ROS生成量显著增加（1.00±0.00vs2.57±0.44,P=0.002），MDA含量也显著增加(1.32±0.37nmol/mlvs9.32±2.21nmol/ml，P=0.001)，SOD活性显著减低(22.82±4.17U/mlvs10.79±2.66U/ml，P=0.000)。与高糖组相比，高糖组+CIN组ROS生成量显著降低(2.57±0.44vs1.61±0.28,P=0.01)，MDA的生成量也显著降低(9.32±2.21nmol/mlvs4.22±1.55nmol/ml，P=0.007)，SOD的活性显著升高(10.79±2.66U/mlvs18.09±3.36U/ml，P=0.001)。与正常组相比，正常组+CIN组ROS、MDA生成量以及SOD活性无显著性差异(P＞0.05)。
　　4.炎症相关指标:与正常组相比，高糖组ICAM-1、VCAM-1 mRNA以及蛋白表达均显著增高（P＜0.05），NF-κBp65蛋白表达也显著增高(P＜0.05);与高糖组相比，高糖组+CIN组ICAM-1、VCAM-1 mRNA以及蛋白表达均显著降低(P＜0.05)、NF-κBp65蛋白表达也显著降低（P＜0.05）。与正常组相比，正常组+CIN组ICAM-1、VCAM-1以及NF-κBp65表达无显著性差异（P＞0.05）。
　　结论:
　　1.高糖可使体外培养的人脐静脉内皮细胞存活减少，而cinaciguat可逆转被高糖抑制的内皮细胞的活性，保护血管内皮细胞。
　　2.高糖使内皮细胞存活减少的机制包括NO的生成减少、氧化应激反应增强以及炎症因子增多。
　　3.cinaciguat可通过提高NO含量，减少氧化应激相关产物ROS和MDA的生成，提高抗氧化酶SOD的活性以及抑制炎症相关指标ICAM-1、VCAM-1、NF-κBp65的表达发挥对内皮细胞的保护作用。

著录项

作者
李亚楠;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科内科学（内分泌与代谢病）
授予学位硕士
导师姓名班博,孙冰;
年度 2016
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R587.205;
关键词
糖尿病血管病变; 可溶性鸟苷酸环化酶激活剂; 高糖环境; 生化指标;

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