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姬松茸子实体多糖对人白血病细胞HL-60细胞的抑制作用及其机制的研究

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摘要

主要英文缩略词表

第一部分 姬松茸子实体多糖的提纯及体外对HL—60细胞作用的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 姬松茸多糖通过Caspase依赖的线粒体途径诱导HL-60细胞凋亡

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分 姬松茸多糖的体内抗肿瘤活性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附表

附图

参考文献

课题创新点及局限性

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摘要

研究背景:
　　尽管不同治疗策略的发展，白血病依旧是最常见的血液系统恶性肿瘤，并且是人类死亡的主要原因。近年来，白血病发病率和死亡率不断上升，针对白血病治疗药物的研究越来越重要。姬松茸，又称为巴西蘑菇，中国也称为梁金菇，经过体外和体内的研究，发现具有包括抗肿瘤、抗病毒、抗炎、保肝、降糖、降脂、抗动脉粥样硬化、抗过敏和免疫调节等作用。越来越多的证据表明，从姬松茸子实体中提取的多糖和多糖蛋白复合物在治疗和预防癌症上，有着很重要的生物活性作用。但是，到目前为止，对于姬松茸子实体多糖对人早幼粒白血病细胞HL-60细胞体外和体内作用的具体机制，还没有系统的说明。考虑到这一点，我们研究了姬松茸多糖体外对人早幼粒白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响和研究多糖的体内抑制肿瘤生长的作用。
　　细胞凋亡信号转导通路主要有两条:内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径，两者最终都通过激活凋亡执行分子:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinylaspartate specific protease，Caspase)来实现。线粒体是细胞凋亡信号转导途径中起关键其作用的细胞器。Bcl-2家族蛋白例如抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和促凋亡蛋白Bax蛋白在细胞凋亡的调节过程中尤其是线粒体途径中起非常重要的作用。在内源性线粒体途径中，当细胞接到凋亡信号刺激，Bax可从细胞质转位到线粒体膜上，在线粒体膜上形成四聚体到十聚体组成的低聚复合物上，导致线粒体跨膜电位的丢失，介导细胞色素-c等物质的释放，细胞色素-c从线粒体膜间释放到细胞浆中，与凋亡蛋白酶激活因子-1(Apoptotic protease activating factor，Apaf-1)结合，形成凋亡体，激活Caspase-9再激活Caspase-3，启动Caspase-3级联反应，诱导细胞凋亡。因此，通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡是抗肿瘤研究的一个热点。
　　目的:
　　1.姬松茸是食药兼用的真菌，它的抗肿瘤活性，已被广泛的应用。多糖是姬松茸治疗肿瘤的主要化学成分，从姬松茸子实体中提取，纯化出姬松茸多糖，来研究它的医学价值。
　　2.通过观察姬松茸多糖在体外对HL-60细胞的作用，探讨姬松茸多糖抑制HL-60生长的具体机制。
　　3.通过构建裸鼠移植瘤模型，通过给裸鼠注射多糖样品，来观察其抑制肿瘤生长的效应，检测多糖对肿瘤细胞的杀伤或清除作用，通过计算抑瘤率等指标来确定多糖的作用效果。
　　方法:
　　1.本实验按照文献略加改进将500g姬松茸子实体用热水提取、Sevage法除蛋白、乙醇沉淀、离子交换层层析提纯后得到姬松茸多糖，酚-硫法检测多糖的含量。
　　2.姬松茸多糖体外诱导白血病细胞凋亡作用实验研究。
　　(1)通过MTT实验观察姬松茸多糖对HL-60细胞的作用。
　　(2)流式细胞技术（AnnexinⅤ/PI双染）检测姬松茸多糖诱导HL-60细胞凋亡的效应。
　　(3) Caspase-3活性检测试剂盒检测姬松茸多糖处理后的HL-60细胞，发现Caspase-3活性的变化。
　　3.姬松茸多糖诱导HL-60细胞凋亡具体机制的研究。
　　(1)采用流式细胞技术检测经姬松茸多糖处理后的HL-60细胞线粒体膜电位变化情况。
　　(2)采用Western blotting方法检测经姬松茸多糖处理后的HL-60细胞细胞色素c(Cyt-c)、Bax蛋白、Bcl-2蛋白、聚-ADP-核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白的变化。
　　4.姬松茸多糖在体内对裸鼠移植瘤模型肿瘤的作用。
　　为了观察姬松茸多糖在体内对白血病细胞的作用，我们通过皮下接种HL-60细胞构建人白血病细胞裸鼠异种移植瘤模型，随机分成生理盐水组，治疗组、和环磷酰胺组，定期测量裸鼠体重，观察裸鼠状态和不良反应，最后，处死裸鼠，称量肿瘤的重量，通过计算抑瘤率等指标来确定多糖的作用效果。
　　结果:
　　1.500g姬松茸子实体分离纯化获得42.4g粗多糖，经过分离纯化得到其中一种多糖，用酚硫法检测其中的多糖含量为89.2％
　　2.通过MTT试验发现姬松茸多糖对HL-60细胞的增殖有抑制作用，并且随着药物浓度的增加，抑制作用增强，具有一定的量效关系。
　　3.流式细胞技术（AnnexinⅤ/PI双染）检测姬松茸多糖诱导人早幼粒白血病细胞株HL-60细胞凋亡的效应，发现随着药物浓度的增加，细胞凋亡率增加，呈现一定的量效关系。
　　4.通过Caspase-3活性检测试剂盒检测经姬松茸多糖处理后的HL-60细胞，Caspase-3活性增加，并且随着药物浓度的增加，活性增强，呈现一定的量效关系。
　　5.流式细胞技术检测经姬松茸多糖处理后的HL-60细胞线粒体膜电位变化情况，发现随着药物浓度的增加，线粒体膜电位丢失增多，呈现一定的量效关系。
　　6.Western blotting检测发现，姬松茸多糖诱导HL-60细胞中细胞色素c从线粒体中释放至细胞浆中，细胞浆中的细胞色素c增加，促凋亡因子Bax蛋白增加，同时抗凋亡蛋白Bcl-2没有明显变化，导致Bax/Bcl-2比值增加，促进细胞凋亡发生。
　　7.Western blotting检测发现，姬松茸多糖处理后的HL-60细胞，被剪切成89KD的PARP增加，并且均随着药物浓度的增加，反应增强，呈现一定的量效关系。
　　8.姬松茸多糖裸鼠体内抑制HL-60细胞移植瘤的生长。姬松茸多糖组裸鼠肿瘤生长受到显著抑制，而体重无明显差异，未观察到明显毒副反应，并且随着治疗剂量的增加，抑制肿瘤生长的作用增强，具有一定的剂量依赖性。提示姬松茸多糖在一定的剂量和疗程内具有高效、低毒的抗白血病效应。
　　结论:
　　1.从姬松茸子实体中通过热水提取、乙醇沉淀、离子交换层层析提纯后，可以得到姬松茸多糖。
　　2.姬松茸多糖在体外能有效的抑制HL-60细胞的增殖，同时这种抑制细胞增殖作用是通过诱导细胞凋亡产生的，因此姬松茸多糖在体外有较强的体外抗白血病效应。
　　3.本研究探明了姬松茸多糖诱导白血病细胞凋亡的机制是通过Caspase依赖的线粒体途径调节的:在姬松茸多糖的作用下，HL-60细胞的Bax蛋白/Bcl-2蛋白比值增加、促进了细胞凋亡，并且导致线粒体膜电位的降低、细胞色素c释放、Caspase-3活性的增强、剪切的PARP片段增多，由此可以推断凋亡的线粒体途径在姬松茸多糖抑制人白血病细胞HL-60细胞的增殖中发挥重要作用。
　　4.通过在体内实验，发现姬松茸多糖能有效地抑制白血病细胞裸鼠移植瘤模型肿瘤的生长，抑制白血病细胞的增殖.

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