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人类卵冠丘复合体中放射冠细胞在受精中的作用及microRNA表达谱及信号通路分析

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第一部分 人类卵冠丘复合体中放射冠细胞在受精中的作用

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图表

第二部分 人类放射冠细胞microRNA表达谱及信号通路分析

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附图表

文献综述 IZUM01、CD9及Juno分子参与受精机制的研究现状

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摘要

第一部分人类卵冠丘复合体中放射冠细胞在受精中作用研究 背景与目的： 人类育龄妇女的卵母细胞发育成熟时，卵母细胞周围包裹大量的颗粒细胞称之为卵冠丘复合体（由卵母细胞、放射冠细胞和外层的颗粒细胞组成）。在辅助生殖技术中，当女方的卵泡发育成熟后，在阴道B超的引导下，将卵冠丘复合体取出体外，卵冠丘复合体取出体外后受精方式有两种，一种是常规的体外受精-胚胎移植技术(In vitro fertilization-embryo transfer, IVF-ET)，即女方的卵冠丘复合体取出体外当天，男方取出精子，当精子密度≥2×107/ml，前向运动精子≥25％，正常形态精子≥4％，可以按一个卵冠丘复合体加1万条精子的比例共同培养，让精子和卵母细胞自由结合受精;另一种受精方式为单精子卵母细胞浆内注射技术（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI），即当男方精子质量不符合上述标准时，我们将卵冠丘复合体的放射冠细胞和外层颗粒细胞拆除，形成仅透明带包裹的卵母细胞，采用显微注射技术将单个精子直接注射到卵母细胞浆内辅助受精。 虽然ICSI技术已经在临床广泛应用，但采用显微注射针将精子注射到卵母细胞内的技术操作对卵母细胞细胞具有创伤性，还具有潜在的将DNA异常的精子或外源异常DNA注射到卵母细胞内而传递给下一代的风险，所以我国卫生部的《人类辅助生殖技术规范》对ICSI技术的严格的限制于重度少、弱、畸形精子症等。 临床实践中，人类卵母细胞的冷冻保存时通常将放射冠细胞和外层颗粒细胞全部拆除，形成仅透明带包裹的裸卵，将裸卵经玻璃化冷冻解冻后，采用ICSI方式受精，因为人们认为卵母细胞玻璃化冷冻解冻后透明带硬化、同时导致卵母细胞浆内的皮质颗粒提前释放，进一步导致卵母细胞膜和透明带的硬化，从而阻止精子进入卵母细胞内受精，必需借助ICSI技术才能保证正常受精。 那么在临床实践中，需要进行卵母细胞冷冻保存的夫妇，当男方的精液参数符合做常规的IVF方式受精时，解冻后的卵母细胞是否必需采用ICSI方式受精？如果保留卵母细胞周围的放射冠细胞能否采用常规的IVF方式受精？ 本研究就是探讨在人类卵冠丘复合体中放射冠细胞在受精中作用及玻璃化冻融的卵母细胞解冻采用常规IVF方式受精的可行性。 材料和方法： 卵冠丘复合体是卵母细胞、放射冠细胞和外层颗粒细胞共同构成，外层颗粒细胞结构疏松，细胞之间充斥大量外基质，称之为卵丘细胞(cumulusoophorus cells，COCs);紧密包裹在卵母细胞透明带周围的内层颗粒细胞又称之为放射冠细胞(Corona radiata cells，CRCs)。 在进行ICSI操作或卵母细胞冷冻保存时，需要用透明质酸酶将COCs和CRCs消化，再用拉细的毛细管将COCs和CRCs拆除，形成的仅有透明带包裹的裸卵来用于ICSI受精或冷冻保存备用，COCs和CRCs是废弃不用的体细胞。本研究就是利用仅有透明带包裹的裸卵结合废弃不用的COCs和CRCs来研究CRCs在人类卵母细胞受精中作用。探讨玻璃化冻融的卵母细胞采用常规体IVF方式受精的可行性，研究方法如下: 1、采用蛋白酶E0.1％(w/v) PBS液中进行透明带消化实验，比较新鲜的卵母细胞和玻璃化冻融卵母细胞透明带消化所需要的平均时间，分析卵母细胞玻璃化冻融后是否存在透明带硬化。 2、采用透射电镜观察新鲜的卵母细胞和玻璃化冻融卵母细胞的皮质颗粒等超微结构，判断卵母细胞玻璃化冻融后是否存在皮质颗粒提前释放现象。 3、有/无CRCs包裹的新鲜卵母细胞以及有/无CRCs包裹的冻融卵母细胞的和精子在体外受精(IVF)，观察各组的受精情况。 4、CRCs包裹的卵母细胞冻融后，常规的IVF受精率及临床妊娠结果观察。 结果： 透明带硬化实验结果显示，人类卵母细胞透明带在蛋白酶E0.1％(w/v) PB8液中消化所需要的平均时间为868.00+11.76秒，保留CRCs玻璃化冷冻组和无CRCs玻璃化冷冻组透明带消化所需的平均时间分别为870.67+12.15秒和868.50+15.35秒，相互之间没有统计学差异，但和阳性对照组（多精受精卵母细胞）所需的平均时间（1083.17+31.55秒）具有明显差异(P＜0.001)。 卵母细胞玻璃化冻融后的透射电镜结果显示，对照组和有/无CRCs包裹透明带的卵母细胞冻融后，其形态、透明带的电子云密度、线粒体、滑面内质网和纺锤体等超微结构没有明显的差异。卵细胞膜下可见皮质颗粒均匀排布。在对照组、无CRCs包裹的卵母细胞冻融组和有CRCs包裹的冻融组每10平方微米的皮质颗粒数分别为8.93±0.28，7.84±0.47和7.93±0.36个，和对照组相比P＞0.05(n=6)。并没有证据表明皮质颗粒提前释放。 有CRCs包裹的卵母细胞玻璃化冷冻解冻后采用常规的体外受精方式受精及胚胎发育情况显示，无CRCs包裹的卵母细胞组受精率18.8％(9/48)，低于有CRCs包裹的卵母细胞组受精率77.1％(37/48)，两者比较具有统计学差异(P＜0.001)。受精后的卵裂率、优质胚胎率均没有差异。在新鲜卵母细胞的对照中具有相似的结果，无CRCs包裹的新鲜卵母细胞组受精率22.6(12/53)，低于有CRCs包裹的新鲜卵母细胞组受精率74.1(40/54)，两者比较具有统计学差异(P＜0.001)。受精后的卵裂率、优质胚胎率均没有差异。在有CRCs包裹的新鲜卵母细胞组和冻融卵母细胞组分别有8例患者接受了胚胎移植，分别获得3例临床妊娠，种植率分别为37.5(6/16)和31.3(5/16)。两者之间没有差别。 15例CRCs包裹的卵母细胞冻融的临床应用结果显示，两种玻璃化冷冻液冷冻保存卵母细胞解冻后的受精率分别为73.8和73.6％，，临床妊娠率分别为50.0和44.4％。 结论： 1、不论新鲜的卵母细胞或冻融的卵母细胞，CRCs包裹可明显改善卵母细胞受精结局。 2、有CRCs包裹的卵母细胞冻融后，可以采用常规的体外受精方式受精 3、人类卵母细胞玻璃化冻融后，没有出现透明带硬化现象 4、有CRCs包裹的卵母细胞冻融后，采用常规的体外受精方式受精形成的胚胎移植可以获得和新鲜胚胎移植相似的临床妊娠率。 第二部分人类放射冠细胞microRNA表达谱及信号通路分析 背景与目的： 在卵泡发生过程中，卵母细胞周围的颗粒细胞根据与卵母细胞的距离和形态可以分为放射冠细胞和卵丘细胞，两者功能类似但又有所区别，共同参与卵母细胞和卵泡的发生、发育以及成熟等卵巢中的关键事件和功能。研究人类卵巢颗粒细胞的基因表达和调控对于认识卵母细胞的发育潜能和研究影响体外受精胚胎移植(in vitro fertilizaiton，IVF)的妊娠成功的因素是非常有益的。然而，关于人类卵巢颗粒细胞基因表达转录后的调控水平的研究尚少。近年来，mi RNA在人类卵巢颗粒细胞内的转录后调控功能引起了广泛的关注。本研究的目的分析人类正常卵巢内的放射冠细胞(corona radiata cells，CRCs)和卵丘细胞(cumulus oophorus cells，COCs) microRNAs(miRNAs)的表达谱，并分析miRNA对卵泡和卵母细胞发育和成熟的影响。 材料和方法： 不孕症患者在接受体外受精-胚胎移植助孕的过程中，女方采用促排卵药物促进卵泡发育成熟后，在阴道超声引导下，穿刺获取卵冠丘复合体，分离其中的CRCs和COCs，对这两种细胞的miRNA进行深度测序获取CRCs和COCs的miRNA表达谱（包括新发现的miRNA），并分析差异表达的miRNA。利用生物信息学软件对差异表达miRNA的下游靶基因进行预测，进而运用GO注释分析和KEGG信号通路富集分析等方法对其潜在的下游调控通路进行富集和筛选。在预测和筛选的基础上，运用实时定量RT-PCR、Western Blot和双荧光素酶报告系统对两种细胞中差异表达miRNA的表达及其下游靶标进行实验验证。 结果： 深度测序结果显示，在CRCs和COCs分别有785和799个已注释的miRNAs被确认。在这两种细胞中共有6个高表达的Novel miRNA被检测到。在CRCs和COCs中共有72个已注释的miRNAs存在差异表达。采用定量real-time PCR分别对已注释的miRNAs、差异表达miRNAs和Novel miRNA进行了定量检测。证明已注释的miRNAs、差异表达miRNAs和Novel miRNA的新一代测序结果是可靠的。在颗粒细胞中广泛参与生物进程的let-7家族的miRNAs伴随有大量的miRNA编辑。GO注释分析和KEGG信号通路富集分析发现，在CRCs和COCs中差异表达的miRNAs参与氨基酸，能量代谢，免疫调节、激素调控、细胞分化、神经发育和调节等多条信号通路。进一步生物信息学分析发现，miR-4286可能通过调控SLC2A1(GLUT1) mRNA和蛋白的表达进而调节颗粒细胞内葡萄糖的运输和代谢。利用定量RT-PCR、Western Blot等方法证实，miR-4286和SLC2A1在CRCs和COCs中的表达呈负相关。同时结合双荧光素酶报告系统等方法发现miR-4286可以直接与SLC2A1的，mRNA相结合，并导致其降解，从而最终影响SLC2A1的表达和功能。 结论: CRC和COC这两种颗粒细胞中72种差异表达的miRNA可能通过影响能量代谢，氨基酸代谢、免疫调节、激素调控、细胞分化、神经发育和调节等多条信号通路参与了卵母细胞和卵泡的发生与发育。在CRCs中高表达的miR-4286可能通过抑制SLC2A1(GLUT1) mRNA和蛋白的表达，进而调控CRCs内葡萄糖的转运，从而影响CRCs对葡萄糖的利用和转化。提示卵泡和卵母细胞发育的过程中，卵母细胞所需的能量主要由COCs，而不是CRCs，通过葡萄糖酵解产生的丙酮酸来提供。总之，通过在CRCs和COCs中miRNAs表达谱、两种细胞差异表达的miRNAs及其靶通路的预测，为卵泡和卵母细胞的发育的研究提供了一种有用的方法，为进一步研究卵巢早衰、多囊卵巢综合症等卵泡发育障碍提供一个有用的技术平台。也为未来理想地控制卵泡的发生和女性生殖、减少生殖相关疾病的发生以及延缓绝经期到来积累新知识、提出新理论、寻找新思路、建立新方法，为提高人口质量、生活质量、促进人类健康做出贡献。

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