利用功能宏基因组技术对北极、大西洋海底沉积物中的新型蛋白酶、酯酶进行筛选、鉴定和性质研究

声明

摘要

符号说明及缩略词

第一章 研究背景和立题依据

1．1 研究背景

1．1．1 蛋白酶的概述

1．1．2 酯类水解酶概述

1．1．3 宏基因组学

1．1．4 功能宏基因组在研究在蛋白酶、酯酶／脂肪酶方面的研究进展

1．1．5 采样位点信息介绍

1．2 立题依据和研究内容

1．2．1 立题依据

1．2．2 研究内容

第二章 通过构建宏基因组文库筛选北极、大西洋海底沉积物中的蛋白酶、酯类水解酶基因

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 环境样品及实验菌株

2．2．2 培养基

2．2．3 主要试剂和试剂盒

2．2．4 主要仪器设备

2．2．5 数据库和分析软件

2．3 实验方法

2．2．1 环境样品的采集

2．3．2 环境样品基因组DNA提取

2．3．3 环境样品基因组DNA的纯化

2．3．4 宏基因组文库的构建

2．3．5 宏基因组文库的功能筛选和克隆子纯化

2．3．6 亚克隆文库的构建以及活性筛选

2．3．7 蛋白酶基因的获取和序列分析

2．4 结果与分析

2．4．1 北极海底沉积物宏基因组文库的构建

2．4．2 大西洋深海表层沉积物fosmid宏基因组文库的构建

2．4．3 Fosmid宏基因组的活性筛选及克隆子纯化

2．4．4 通过构建亚克隆文库确定编码蛋白酶的基因序列

2．4．5 编码蛋白酶基因的序列分析

2．5 讨论

第三章 蛋白酶的异源表达及其酶学性质研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 环境样品及实验菌株

3．2．2 培养基

3．2．3 主要试剂和试剂盒

3．2．4 主要仪器设备

3．2．5 数据库和分析软件

3．3 实验方法

3．3．1 蛋白酶3C的基因克隆

3．3．2 重组酶的异源表达

3．3．3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测

3．3．4 胞内蛋白酶的分离纯化

3．3．5 胞外蛋白酶的分离纯化

3．3．6 蛋白酶的活性检测

3．3．7 蛋白浓度测定

3．3．8 最适反应温度及温度稳定性分析

3．3．9 最适反应pH

3．3．10 NaCl对酶活性的影响

3．3．11 金属离子对酶活性的影响

3．2．12 抑制剂与变性剂对酶活性的影响

3．4 结果与分析

3．4．1 蛋白酶3C的基因克隆

3．4．2 蛋白酶3C基因序列分析以及结构域分析

3．4．2 蛋白酶3C的异源表达

3．4．3 胞内蛋白酶3C的分离纯化及活性检测

3．4．4 胞外蛋白酶3C的表达及纯化

3．4．5 蛋白酶3C Superdex-75凝胶过滤层析纯化效果分析

3．4．6 蛋白酶3C底物特异性分析

3．4．7 最适反应温度及温度稳定性分析

3．4．8 最适pH分析

3．4．9 NaCl对酶活的影响

3．4．10 金属离子对酶活的影响

3．4．11 抑制剂对酶活的影响

3．5 讨论

全文总结与展望

参考文献

致谢