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基于抑制狼疮小鼠B淋巴细胞分化的Blimp-1 SiRNA防治狼疮肾炎的机制研究

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摘要

符号说明

第一部分：Blimp-1 SiRNA重组腺病毒载体构建

前言

材料与方法

三．结果

四．讨论

五．结论

参考文献

第二部分：Blimp-1 SiRNA对Blimp-1表达和B细胞分化影响

前言

材料和方法

四．结果

五． 讨论

参考文献

第三部分：Blimp-1 SiRNA对系统性红斑狼疮病情活动的作用

前言

一．实验材料

二．实验方法

四．实验结果

五．讨论

附图

参考文献

总结

创新点

局限性

综述 转录因子Blimp-1与淋巴细胞

致谢

攻读学位期间的科研成果

学位论文评阅及答辩情况表

Paper 1

Paper Ⅱ

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摘要

SLE患者由于免疫耐受的异常和B淋巴细胞发育过程中存在轻重不一的缺陷，表现为身体内明显增多的对自身组织反应的B淋巴细胞，从而会生成以抗核抗体和双链DNA抗体为代表的多种多样的自身抗体，随时间发展越来越多的免疫复合物沉积最后临床出现结缔组织病[1-3]。同时B淋巴细胞内及细胞间也存在各种异常:1.信号转导异常如细胞内酪氨酸磷酸化及激酶水平升高，涉及细胞分化、存活、迁移和细胞周期异常等。2.B细胞相关的细胞因子失调如B淋巴细胞刺激因子(B-lymphocyte stimulator，BLyS)活性明显增加远远超过正常[4，5]。3.B细胞相关亚群异常如调节性B细胞功能缺陷。针对自身的B淋巴细胞免疫反应被多种因素增强。
　　作为锌指蛋白家族成员之一的B淋巴细胞诱导成熟蛋白-1(B lymphocyte induced maturation protein-1，Blimp-1)是由Turner于1994年报道[6，7]。作为DNA结合蛋白的Blimp-1由PR区锌指蛋白1(PRDM1)基因编码，主要功能是抑制转录。其中B淋巴细胞相关转录因子是被抑制的重要对象，它决定B细胞终末分化，促进B细胞分化为能够分泌免疫球蛋白的浆细胞，并影响它的存活。Blimp-1表达异常会导致自身免疫功能失调，诱发系统性红斑狼疮等自身免疫相关疾病[8，9]。
　　研究认为Blimp-1促进B细胞分化主要通过调节三类因子表达:1.Blimp-1下调c-Myc、E2F1抑制B细胞分裂和增殖;2.Blimp-1促进J链、XBP-1表达及Ig重链和轻链重排，增强抗体分泌;3.Blimp-1下调生发中心B细胞Pax-5、bcl-6表达。Blimp-1表达而发挥促B淋巴细胞分化作用需要抑制因子Bcl-6、Pax-5、MITF和诱导因子XBP-1、IRF4、AP-1、NF-KB、STAT3之间平衡[10,11]。
　　Blimp-1基因是狼疮性肾炎的一个易感基因，其可能在系统性红斑狼疮发生发展中起关键性作用。GaraudJC[12]等研究发现红斑狼疮患者外周血B细胞Blimp-1mRNAs呈高表达。PanchanathanR[13]实验中Blimp-1基因表达缺失雌性小鼠产生高滴度的狼疮样自身抗体。国内牛晓昶[14]研究狼疮病人Blimp-1蛋白高表达，成熟浆细胞数明显增加。总之目前实验证据表明Blimp-1与包括红斑狼疮在内的多种自身免疫性疾病有密切关联。
　　RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象[15]是把体外与自身mRNA互补的双链RNA通过各种基因转移手段导入细胞，导致与自身序列互补相同的mRNA降解。产生结果是阻止了相关mRNA翻译，也就是关于此mRNA的基因不再表达而变为沉默基因，即通常说的转录后基因沉默。1990年约根森(Jorgensen)[16]研究小组在研究查尔酮合成酶对花青素合成速度的影响时发现RNA干扰现象。之后这种现象逐渐被验证并于1998年由AndrewZ.Fire[17]等详细阐述。目前，以核酸为基础RNAi技术在癌症和自身免疫相关疾病治疗中开始展现良好前景。
　　成熟浆细胞产生的多种自身抗体在系统性红斑狼疮患者病情中起决定性作用[3]。Blimp-1决定B淋巴细胞终末分化和多种自身反应性抗体分泌，Blimp-1异常与红斑狼疮的发生密切相关[14]。基于以上背景为了探讨Blimp-1在狼疮发展中的潜在作用，我们构建了编码Blimp-1SiRNA的腺病毒载体。探讨Blimp-1SiRNA对Blimp-1表达及CD138+B细胞比例影响，进而观察B淋巴细胞分化情况。另外从SLE临床角度研究了Blimp-1SiRNA对系统性红斑狼疮病情作用，包括（抗双链DNA抗体、尿蛋白、肾功能、血清白蛋白等）。
　　方法:基因库获得Blimp-1互补DNA，合成Blimp-1SiRNA序列。扩增鉴定后与表达质粒PDC315载体连接，获得阳性克隆质粒命名为PDC315-RNAi。Adeno-XTM载体系统与PDC315-RNAi及骨架质粒pBHGloXE1.3Cre经酶切后重组，获得阳性克隆质粒命名为pAd-Blimp-1/siRNA[18-20]。Lipofectamine2000试剂将pAd-Blimp-1/siRNA载体转染293细胞，3次感染得第四代重组腺病毒pAd-Blimp-1/siRNA。同法获得第四代重组腺病毒pAd-siRNA/LacZ作为阴性对照。12周BWF1小鼠尾静脉注射pAd-siRNA/Blimp-1（1*109空斑形成单位）。对照组分别注射pAd-siRNA/LacZ（1*109空斑形成单位）和PBS溶液100ul。每三周处死小鼠用流式细胞仪分析CD138+细胞比率。对腺病毒注射21天小鼠分别应用RT-PCR检测Blimp-1mRNA表达和Western-Blot检测Blimp-1蛋白、XBP-1蛋白、BCMA蛋白及C-myc蛋白表达。每三周对小鼠酶联免疫分析抗双链DNA抗体滴度(u/ml)，自动生化仪检测尿素氮、肌酐、血清白蛋白，考马斯亮蓝法测定尿蛋白含量[21，22]，同时观察各组小鼠生存期，腺病毒注射18周时分别观察各组小鼠肾组织病理变化。
　　结果:
　　1.构建了编码Blimp-1SiRNA重组腺病毒载体。
　　2.对照组12周后CD138+B细胞比例开始上升，24周达到高峰8.51±3.08％。而Ad-siRNA/Blimp-1组一直保持相对稳定(p＜0.05)。
　　3.Ad-siRNA/Blimp-1组RT-PCR示脾脏B细胞Blimp-1mRNA表达抑制率68％，Blimp-170.6％、XBP-1、BCMA蛋白表达下降，C-Myc蛋白表达上升，与对照组比较p＜0.05。
　　4.Ad-siRNA/Blimp-1组抗双链DNA抗体滴度维持在基线，对照组抗体水平从200-3000u/ml逐步上升(p＜0.05)，15周后白蛋白下降缓慢。
　　5.模型鼠自第3周开始出现尿蛋白升高，Ad-SiRNA/Blimp-1干扰组从12周尿蛋白排泄明显减少，较对照组明显下降（p＜0.05），Ad-SiRNA/LacZ组与PBS组比较差异无统计学意义p＞0.05（12周p＜0.05）。
　　6.各组模型小鼠血清肌酐24周观察期呈现升高趋势，12周前三组肾功能均正常，变化不明显，组间无统计学差异p＞0.05。15周对照组血清肌酐开始明显升高，之后9周发展较快。与对照组比较p＜0.01。
　　7.Ad-siRNA/Blimp-1组小鼠15周无死亡，对照组15周（造模6月）开始死亡，PBS组2只，Ad-SiRNA/LacZ3只，直至24周（造模9月）时对照组小鼠死亡PBS组7只，Ad-SiRNA/LacZ死亡8只，Ad-siRNA/Blimp-1组存活8只，以存活比例和尾静脉注射后死亡时间作Kaplan-meier生存曲线，对照组小鼠生存期明显缩短，经Logrank检验Ad-siRNA/Blimp-1组和对照组比较有统计学差异，Log值6.80，P=0.03，(p＜0.05).三组半数生存期分别为:＞24W(Ad-siRNA/Blimp-1组)，21W(Ad-SiRNA/LacZ),23W(PBS组)。
　　8.Ad-siRNA/Blimp-1组肾小球体积轻度增大，仅有轻度系膜细胞基质增生，小球炎症细胞浸润轻，无间质纤维化，血管壁轻度增厚，小管周围炎症细胞轻度增生。模型对照组肾小球体积增大，弥漫性增生，系膜基质增加，炎症细胞侵润重，PBS组小球节段结构不清，血管壁结构破坏。肾小球和小管损伤计分与Ad-siRNA/Blimp-i组比较p＜0.05。
　　结论:
　　1.Blimp-1SiRNA解除了对C-myc途径抑制，使其上调表达，下调了B淋巴细胞Blimp-1、XBP-1、BCMA蛋白及Blimp-1mRNA表达，抑制活体B细胞向浆细胞分化。
　　2.Blimp-1SiRNA降低了狼疮鼠双链DNA抗体滴度，进而降低了蛋白尿，升高血清白蛋白，保护狼疮鼠肾脏功能，减轻炎性细胞在肾组织沉积，阻止狼疮发展。
　　3.Blimp-1SiRNA可能给我们提供一条通过阻止B细胞分化治疗狼疮的新道路。

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