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【6h】

整合素αvβ6内吞胞吐循环在调控结肠癌细胞迁移中的作用及分子机制研究

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摘要

研究背景和意义：
　　 结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，随着我国人民生活水平的提高和饮食结构的改变，结肠癌的发病率有逐年增高的趋势，虽然近年来医疗诊治水平有了很大的提高，但其死亡率仍居高不下，仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤死亡率第三位，严重危害人民群众健康。
　　 整合素属于黏附分子家族，是一类由α、β亚单位以非共价键结合组成的跨膜糖蛋白受体，介导细胞间及细胞与细胞外基质的黏附作用，通过细胞内外信号传导促进细胞增殖、分化、侵袭和转移。整合素在细胞迁移中的作用主要是通过其与细胞外基质配体不断的连接与解离实现，直接介导细胞的定向迁移过程。整合素αvβ6是一类只表达于恶性上皮性肿瘤组织而在正常及良性肿瘤组织不表达的特殊整合素亚型，在腺上皮来源消化道肿瘤如结直肠癌、胃癌、胰腺癌、胆管癌中高表达;鳞状上皮来源肿瘤如肺癌、口腔鳞状上皮癌亦可见其表达;且主要表达于肿瘤侵袭边缘，与多种肿瘤的恶性行为密切相关。
　　 我们在前期研究发现，整合素αvβ6的表达与结肠癌病理类型、分化程度、TNM分期密切相关，整合素αvβ6阳性表达患者生存期明显缩短，可作为结肠癌独立的不良预后指标;体外细胞实验证实整合素αvβ6的表达可以提高结肠癌细胞增殖、侵袭能力，并在一定程度上提高结肠癌细胞抵御凋亡、对抗化疗药物的能力;我们发现在整合素β6亚单位与ERK2之间存在直接连接，并明确了β6胞内段与ERK2的结合位点（746EAERSKAKWQTGTNPLYRG764，下划线处表示两者结合位点），与整合素β6连接的ERK2分子的磷酸化水平更高，提示这种连接可能在一定程度上使ERK2分子发生构象改变，从而更容易被磷酸化，而且能够保护与其β6连接的ERK2分子不容易被细胞质中的磷酸酶去磷酸化而失活;不同细胞密度培养实验证实，随着结肠癌细胞密度增加伴随有PKC活性增强和细胞表面αvβ6的表达增多，
　　 20世纪70年代末和80年代初，人们在研究中发现一些真核细胞的膜蛋白并不是静止地存在于细胞膜上，而是在细胞亚结构中以一种动态流转的形式存在，持续进行一个内吞胞吐的循环过程，如纤连蛋白受体、LDL受体和转铁蛋白受体等，并逐步建立完善了这种内吞胞吐循环的检测方法。作为一种膜蛋白受体，大量实验证实整合素也存在这样持续快速的内吞胞吐循环过程，而且整合素的α链能够决定其是否参与内吞胞吐循环过程以及循环的速率，例如α5β1、α6β4和Mac-1等整合素都参与细胞内吞胞吐循环过程，但α3β1、α4β1和LFA-1等却循环得很慢，或根本不存在内吞胞吐循环。2007年英国的JohnF.Mashall教授在口腔鳞状细胞癌细胞中检测证实了整合素αvβ6的内吞胞吐循环过程，提示整合素αvβ6在细胞内也是以这种快速循环的形式存在的。
　　 本课题拟在前期整合素αvβ6系统研究的基础上，结合近年来整合素内吞胞吐循环的理论及实验检测方法，研究整合素αvβ6内吞胞吐循环在调控结肠癌细胞恶性生物学行为中的作用，尤其是对细胞迁移能力的影响，探讨整合素αvβ6-ERK2直接连接在整合素αvβ6内吞胞吐循环中的连接与解离状态及所发挥的作用等，为进一步深入认识整合素αvβ6在结肠癌细胞中的作用及存在形式，为今后揭示整合素αvβ6内吞胞吐循环调控的分子机制，并进行靶向干预治疗，提供实验依据和理论基础。
　　 第一部分
　　 整合素αvβ6在结肠癌细胞中内吞胞吐循环检测方法的建立
　　 目的
　　 摸索建立整合素αvβ6在结肠癌细胞中的内吞胞吐循环检测体系。
　　 方法(1)内吞实验:将结肠癌细胞在4℃下用0.2mg/ml的EZ-LinkSulfo-NHS-SS-Biotin溶液对膜蛋白进行生物素标记;标记后的细胞加入含10％FBS的培养基在37℃下培养;一定时间（5、10、15、30、60min等）后，倒出培养基，将培养瓶迅速转移到冰上，冷PBS冲洗2遍后，加入含有20mMMesNa的Tris缓冲溶液(pH8.6)在4℃下处理15min，去除仍存在于细胞膜上的生物素;加入20mM的碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)处理10min去除过量的MesNa;收集细胞，提取蛋白，检测蛋白浓度，进行整合素αvβ6的capture-ELISA检测。(2)胞吐实验:开始步骤类似于内吞实验，只是将细胞生物素标记后，在孵箱中培养30min，进行一次MesNa溶液处理，再次放入孵箱中启动胞吐过程，待指定时间（0，5，10，30min等）后，取出细胞置于冰上，第二次用MesNa溶液去除细胞表面胞吐出的αvβ6，通过capture-ELISA实验检测剩余未胞吐αvβ6的含量，从而判断细胞αvβ6胞吐的时相及比例。(3)Capture-ELISA:首先用5μg/ml10D5、0.05MNa2CO3(pH9.6)溶液在4℃下对96孔板进行抗体包被过夜;用含0.05％Tween-20、5％BSA的PBS-T溶液在室温下封闭1h;将50μl细胞裂解液置入包被完成的96孔板中，在4℃下孵育过夜，进行β6的捕捉;未结合的细胞裂解产物物可以通过PBS-T大量冲洗去除;将96孔板在含有抗生物素蛋白链菌素偶联的辣根过氧化物酶（streptavidin-conjugatedhorseradishperoxidase）并包含1％BSA的PBS-T作用下，4℃孵育1h;加入邻苯二胺（ortho-phenylenediamine，OPD）显色液室温显色10min，加入终止液终止反应后492nm上机读数。
　　 结果
　　 经过对内吞实验、胞吐实验、capture-ELISA各种实验条件的摸索，初步构建了整合素αvβ6在结肠癌细胞中内吞胞吐循环检测体系，加入阳性对照组与阴性对照组对实验结果的敏感性和特异性进行检测，证实实验结果可靠。随即对结肠癌细胞系HT29和WiDr分别进行了整合素αvβ6内吞和胞吐检测，发现在这两种细胞中，整合素αvβ6在进行持续内吞胞吐循环，内吞比例在30min达到最大值，并且通过30min时间可有70％左右的整合素αvβ6重新胞吐到细胞表面。
　　 结论：
　　 在结肠癌HT29和WiDr细胞中，整合素αvβ6持续进行内吞胞吐循环，这是其一般性存在状态，它的一切生物学行为必将建立在这样的运动模式基础上。
　　 意义：
　　 该实验检测体系的建立为进一步研究整合素αvβ6内吞胞吐循环在调控结肠癌细胞恶性生物学行为中的作用及分子机制奠定了基础。
　　 第二部分整合素αvβ6-ERK2直接连接对αvβ6内吞胞吐循环的影响
　　 目的
　　 探讨整合素αvβ6-ERK2直接连接对αvβ6内吞胞吐循环的影响。
　　 方法
　　 利用MAPK信号传导通路中ERK2上游MEK的抑制剂PD98059处理细胞抑制ERK2磷酸化，或转染敲除ERK2结合位点的Del.Mutantβ6入SW480细胞(αvβ6阴性表达)，利用内吞实验、胞吐实验检测在这种状态下αvβ6内吞胞吐循环时相，与自然状态下的αvβ6的循环时相分析比较，确定干预整合素αvβ6-ERK2直接连接对αvβ6内吞胞吐循环的影响。
　　 结果
　　 实验数据显示抑制ERK磷酸化后可以抑制整合素αvβ6的内吞过程，但对其胞吐过程没有影响，同样，敲除β6胞内段的ERK2结合位点能够抑制αvβ6的内吞过程，但对其胞吐过程几乎没有影响。值得注意的是，在内吞起始5min内，敲除β6胞内段的ERK2结合位点能延缓内吞过程，但PD98059对起始5min的内吞过程没有影响。
　　 结论：
　　 整合素αvβ6的内吞启动过程在一定程度上受与之直接连接的ERK2磷酸化程度的影响，而且与ERK2连接，尤其是与磷酸化ERK2的连接，可以促进整合素αvβ6的内吞过程的启动。
　　 意义：
　　 阐明了整合素αvβ6-ERK2直接连接在整合素αvβ6内吞胞吐过程中的作用和影响，为进一步揭示该过程的分子机制奠定了基础。
　　 第三部分整合素αvβ6内吞胞吐循环在调控结肠癌细胞迁移中的作用
　　 目的
　　 探讨整合素αvβ6内吞胞吐循环在结肠癌细胞迁移过程中的作用。
　　 方法
　　 对整合素αvβ6阳性表达的结肠癌HT29细胞给予三种手段干预，分别是10D5抗体功能性阻断αvβ6、PD98059抑制ERK磷酸化、primaquine抑制胞内空泡运输，通过迁移实验观察细胞在纤连蛋白表面迁移能力的改变;另外，向整合素αvβ6阴性表达的结肠癌SW480细胞分别转染wild-typeβ6、Del.Mutantβ6和空载体，观察这三种细胞迁移能力的差别，同样对三种细胞给予10D5抗体、PD98059和primaquine处理，观察对三种细胞迁移能力影响的不同。
　　 结果
　　 实验结果显示，10D5抗体、PD98059和primaquine均能够抑制HT29细胞在纤连蛋白表面的迁移能力;SW480wild-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三种细胞在纤连蛋白表面的迁移能力明显不同，SW480wild-typeβ6细胞明显强于另外两种细胞，提示整合素αvβ6及αvβ6-ERK2直接连接在结肠癌细胞迁移过程中发挥重要作用;对SW480wild-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三种细胞分别给予10D5抗体、PD98059和primaquine处理，均能够明显抑制SW480wild-typeβ6细胞在纤连蛋白表面的迁移能力，一方面说明这种迁移能力是由整合素αvβ6介导，另一方面也说明αvβ6-ERK2直接连接、αvβ6内吞胞吐循环在其中发挥重要作用。
　　 结论
　　 结肠癌HT29细胞和SW480wild-typeβ6细胞在纤连蛋白表面的迁移主要是由整合素αvβ6介导，而且在这个过程中整合素αvβ6-ERK2直接连接、整合素αvβ6内吞胞吐循环均发挥重要作用，在整合素αvβ6、αvβ6-ERK2直接连接、αvβ6内吞胞吐循环三个水平给予干预均可以抑制结肠癌细胞在纤连蛋白表面的迁移能力。
　　 意义
　　 证实了整合素αvβ6在结肠癌细胞迁移过程中的重要作用，并进一步揭示了整合素αvβ6-ERK2直接连接、整合素αvβ6内吞胞吐循环在结肠癌细胞迁移过程中的作用。
　　 第四部分
　　 PKC对整合素αvβ6内吞胞吐循环及其作用的影响
　　 目的
　　 探讨PKC对整合素αvβ6内吞胞吐循环及其介导的细胞迁移的影响。
　　 方法
　　 首先，利用PKC激活剂PMA处理细胞，通过内吞实验、胞吐实验检测PKC激活对整合素αvβ6内吞胞吐循环的影响，同时给予PMA和PD98059处理，观察整合素αvβ6内吞胞吐循环的变化;然后，在HT29细胞或SW480wild-typeβ6、SW480Del.Mutantβ6、SW480mock三种细胞中，给予PMA处理，并结合应用10D5抗体、PD98059和primaquine等，观察对结肠癌细胞在纤连蛋白表面迁移的影响。
　　 结果
　　 实验结果证实，PKC激活能够促进整合素αvβ6的内吞胞吐循环，并且对内吞、胞吐过程都有加速作用;同时应用PMA和PD98059能够在一定程度上抵消PKC激活对整合素αvβ6内吞的影响，但对整合素αvβ6胞吐仍有促进作用;PKC激活能够促进结肠癌HT29细胞在纤连蛋白表面的迁移，同时应用10D5抗体、PD98059和primaquine能在一定程度上抵消这种促进作用;PKC激活能够显著促进SW480wild-typeβ6细胞在纤连蛋白表面的迁移能力，但对SW480Del.Mutantβ6、SW480mock细胞影响不明显。
　　 结论
　　 PKC激活能够加速整合素αvβ6内吞胞吐循环，并能提高αvβ6表达阳性结肠癌细胞在纤连蛋白表面的迁移能力，而且这种促进作用是通过整合素αvβ6依赖的方式实现的。
　　 意义
　　 阐明了PKC在整合素αvβ6内吞胞吐循环及其介导的结肠癌细胞迁移过程中的作用，为进一步研究整合素αvβ6内吞胞吐循环的调控机制打下了基础。
　　 第五部分
　　 高/低细胞密度培养对整合素αvβ6亚细胞结构分布的影响
　　 目的
　　 研究在细胞高/低密度培养环境下整合素αvβ6在结肠癌HT29细胞表面分布情况的改变，并通过整合素αvβ6内吞胞吐循环理论对这个现象进行解释。
　　 方法
　　 对于高、低细胞密度培养下的结肠癌HT29细胞，分别通过内吞实验、胞吐实验检测整合素αvβ6内吞胞吐循环时相的差异，并利用流式细胞仪检测不同细胞密度培养条件下HT29细胞表面整合素αvβ6数量改变，收集两种状态下的细胞，westernblot检测细胞总蛋白中整合素αvβ6的含量，进一步对这个现象进行解释。
　　 结果
　　 实验结果证实，高密度培养条件下HT29细胞表面整合素αvβ6数量较多，并且高细胞密度培养能够加速整合素αvβ6的内吞胞吐循环过程，而在细胞总蛋白中整合素αvβ6的总量并没有显著变化。
　　 结论
　　 结肠癌细胞在高密度培养状态下，细胞膜上整合素αvβ6数量增多是其在细胞亚结构重分布的结果，而整合素αvβ6内吞胞吐循环在这个调节过程中发挥重要作用。细胞短时间内会动员胞浆内大量整合素αvβ6进入内吞胞吐循环，并使内吞胞吐循环速度加快，促进结肠癌细胞迁移。
　　 意义
　　 结肠癌细胞在高密度培养状态下，生存空间和营养状态都相对不足，细胞具有一种向外迁移的需求，以获取充足的空间和营养，该研究很好的解释了这一现象。

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