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蓖麻毒素的提取、纯化以及293a细胞在其毒性作用下的蛋白质组学初步分析

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论文说明:图表目录

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前言

1蛋白质组学简介

1.1蛋白质组的概念

1.2蛋白质组学的研究方法与技术

2蓖麻及蓖麻毒素简介

2.1蓖麻简介

2.2蓖麻毒素简介

3培养细胞学简介

3.1培养细胞学的发展

3.2培养细胞学研究的内容

3.3细胞培养学的特点

4本文研究的目的与意义

第一章 蓖麻毒蛋白的提取、纯化

1材料、试剂与仪器设备

1.1实验材料

1.2主要试剂

1.3主要设备

1.4主要消耗材料

2蓖麻毒素的提取与纯化方法

2.1蓖麻粗毒的提取与纯化

2.2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

2.3蛋白浓度测定

3结果与分析

3.1蓖麻毒素的纯化

3.2蓖麻毒素浓度的测定

3.3小结

第二章自制蓖麻毒素细胞毒性实验

1材料、试剂与仪器设备

1.1实验材料

1.2主要试剂

1.3主要设备

1.4主要消耗器材

2 293a细胞毒性检测实验

2.1 293a细胞的复苏

2.2 293a细胞的传代培养

2.3 293a细胞毒性检测(MTS法测定细胞毒性)

3结果与分析

3.1 293a细胞培养

3.2 MTS检测

3.3小结

第三章 293a细胞攻毒与细胞全蛋白提取

1材料、试剂与仪器设备

1.1实验材料

1.2主要试剂

1.3主要设备

1.4主要消耗器材

2 293a细胞攻毒与细胞总蛋白的提取

2.1玻璃培养皿的清洗、包装与消毒

2.2 293a细胞的传代与扩大培养

2.3 293a细胞的攻毒

2.4 293a细胞的收集

2.5 293a细胞总蛋白的提取

2.6 293a细胞总蛋白浓度的测定

2.7蛋白样品的处理

2.8蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

3结果与分析

3.1 293a细胞的攻毒

3.2 293a细胞总蛋白浓度的测定

3.3蛋白样品的SDS-PAGE

3.4小结

第四章蛋白样品的双向电泳

1试剂与仪器设备

1.1材料

1.2主要试剂

1.3仪器设备

2双向凝胶电泳

2.1第一向等电聚焦(用自制的电泳上样缓冲液,7cm的胶条,pH 3-10,非线性)

2.2第二向SDS-PAGE电泳

3结果与分析

3.1等电聚焦程序的设置

3.2第二向SDS-PAGE电泳

3.3小结

第五章质谱鉴定和生物信息学比较

1材料、试剂与仪器设备

1.1实验材料

1.2主要试剂

1.3主要设备

2差异蛋白的分析与鉴定

2.1差异蛋白的凝胶图象分析

2.2差异蛋白质样品的胶内酶解

2.3差异蛋白的质谱鉴定

3结果与分析

3.1差异蛋白的2D图像分析

3.2差异蛋白的质谱分析

3.3小结

第六章讨论

1差异表达蛋白的功能讨论

1.1蛋白质点S5的功能讨论

1.2蛋白质点S11的功能讨论

参考文献

附录

致谢

作者简介

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摘要

以大规模分析蛋白质作为主要研究内容的蛋白质组学是功能基因组研究的主要内容之一,蛋白质组学分析技术取得的重大进步使细胞内全蛋白的组成及其活动规律的研究成为热点。本实验以蓖麻籽为实验材料,采用硫酸铵沉淀法提取了蓖麻毒素粗毒,利用亲和层析与凝胶过滤层析纯化了蓖麻籽中的蓖麻毒素,并从细胞水平研究了蓖麻毒素的毒性作用以及纯化后的蓖麻毒素与标准品在毒性方面的差异。同时应用二维凝胶电泳、肽质量指纹质谱测定、蛋白质数据库比对等蛋白质组学技术研究了纯化后的蓖麻毒素的毒性作用对293a细胞蛋白质组的影响,并对诱导蛋白的类型及其所对应的功能进行了分析。取得了以下研究结果:
   采用硫酸铵沉淀法提取了蓖麻毒素的粗毒,应用Sepharose4B柱亲和层析和Sephacryl S-200柱凝胶过滤层析对蓖麻毒素进行了纯化,SDS-PAGE鉴定表明纯化后的蓖麻毒素达到了电泳纯。
   用毒素标准品和自制毒素对293a细胞进行毒性实验,将毒素标准品和自制毒素稀释为0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μgml、100μg/ml5个浓度梯度,同时设置空白孔(未接种细胞)和对照组(未接种毒素),结果表明无论是蓖麻毒素标准品还是自制蓖麻毒素.随着攻毒浓度的提高,细胞存活率都呈现下降趋势;攻毒浓度从1μg/ml提高10ug/ml,无论是标准品还是自制毒素,细胞存活率都在该浓度范围内下降最大,并且自制蓖麻毒素的降幅比蓖麻毒素标准品的降幅略大。
   用浓度为1μg/ml的毒素对293a细胞攻毒,同时设置对照组(未接种毒素),在倒置显微镜下可见攻毒细胞发生明显的形态变化。提取细胞总蛋白后,以正常293a细胞总蛋白为对照与攻毒293a细胞总蛋白同时进行等电聚焦和2-D凝胶电泳,然后对凝胶进行考马斯亮蓝染色,可以看出攻毒293a细胞的蛋白质组发生明显的调整。选取15个差异表达的蛋白质点进行酶解、质谱鉴定,得到了2种可能与蓖麻毒素运输与毒性作用相关的蛋白质。

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