外周血淋巴细胞HLA-A mRNA检测在肾移植早期排斥反应中的作用探讨

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目的： 1．建立检测外周血淋巴细胞(PBL)人类主要组织相容性抗原-A(HLA-A)mRNA的一步法荧光定量逆转录聚合酶链反应(FQ-RT-PCR)的方法，初步应用于肾移植患者移植前后外周血淋巴细胞HLA-AmRNA表达的检测。探讨淋巴细胞HLA-A mRNA的表达与机体免疫状态及移植后早期急性排斥反应的关系。 2．通过对HLA-AmRNA、CD4/CD8比值、血肌酐(sCr)、尿素氮(BUN)、淋巴细胞数各项指标的比较，探讨淋巴细胞HLA-AmRNA作为早期急性排异反应评估指标的价值。方法：依据GenBank中人HLA-AmRNA序列，根据HLA-A基因外显子4、5中的保守序列自主设计、筛选引物及探针；以管家基因葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose6-phosphate dehydrogenasem，G6PDH)作为内参照，设计引物及探针。运用Taqman探针技术，荧光定量RT-PCR扩增HLA-A mRNA和G6PDH mRNA。检测35例随访的肾移植患者的术前及术后半年内不同时间的标本的阈循环数(Ct)和60例正常对照的阈循环数(Ct)，采用REST软件分析其外周血淋巴细胞表面HLA-A mRNA的相对表达量。测定值大于等于正常值或者在连续监测过程中表达较前显著增强的肾移植患者，考虑有早期急性排斥反应发生。以流式细胞术连续检测CD4/CD8比值，ELISA检测免疫抑制剂药物浓度，评估机体的免疫状态。血生化仪测定血肌酐、尿素氮。结果： 1．健康正常对照人群外周血淋巴细胞HLA-A mRNA的相对表达量是(1.14±0.32)。将此值设为目前外周血淋巴细胞HLA-AmRNA检测的临界值。 2．移植前外周血淋巴细胞HLA-A mRNA的相对表达量(1.03±0.56)与正常对照比较无差异(P>0.05)。 3．术后应用免疫抑制剂，肾功能稳定组一月内外周血淋巴细胞HLA-AmRNA的相对表达量与正常对照组相比均降低(P<0.05)。 4．术后急性排斥反应组排斥反应期外周血淋巴细胞HLA-A mRNA的相对表达升高(P<0.05)。与肾功能稳定组同一时间相比，5例排斥反应患者术后一月内不同时间外周血淋巴细胞HLA-A mRNA表达在排斥反应发生时显著升高(P<0.05)。 5．HLA-A mRNA作为监测早期急性排斥反应的指标的敏感性是80％，特异性是90.3％，阳性预测率是66.7％，阴性预测率是96.5％。结合血肌酐检测，可提高其检测的敏感性和特异性。 6．移植术前后连续监测外周血T淋巴细胞亚群CD4/CD8比值，排斥反应发生时较正常对照组明显升高(P<0.05)，比值均>1.5。血药浓度监测，口服药物吸收不规则，存在很大的个体差异。HLA-A单项诊断排斥反应时变化更明显，性能优于其他指标。结论： 1．成功建立了简便快速、特异、重复性好、可信度高的检测外周血淋巴细胞HLA-A mRNA基因表达的FQ-RT-PCR方法。结合REStT软件，采用比较Ct值的分析方法对淋巴细胞HLA-AmRNA进行相对定量。 2．外周血淋巴细胞HLA-AmRNA作为一个评估机体免疫状态和预测早期排斥反应发生的指标具有无创性，敏感性80％，特异性90.3％，阳性预测率66.7％，阴性预测率96.5％的特点。结合临床血肌酐指标，可以进一步提高HLA-A mRNA检测的敏感性和特异性，使外周血淋巴细胞HLA-A mRNA检测具有良好的预测早期排斥反应的前景。 3．HLA-A mRNA、血肌酐波动和CD4/CD8比值，三项指标单项诊断排斥反应发生的性能比较，显示HLA-AmRNA具有很高的临床应用价值，可以简便、省时、准确的应用于大量的移植患者的监测。意义：本研究初步找到一种评估器官移植之后早期排斥反应的指标，能够预测排斥反应的发生。这一发现应用于器官移植监测有助于指导临床及时处理早期急性排斥反应的病人，调整免疫抑制剂的用量，从而提高器官移植后的远期存活率。

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作者
李晓丽;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科临床检验诊断学
授予学位硕士
导师姓名邹雄;
年度 2006
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类免疫学检验方法;
关键词
人类白细胞抗原; HLA; 移植; 实时荧光定量逆转录PCR; 基因表达; REST软件; 流式细胞术;

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