灰色链霉菌RX-17溶菌酶基因文库的构建及筛选

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灰色链霉菌RX-17所产的溶菌酶系，不仅具有β-1，4-N-乙酰胞壁质酶活力，还具有β-1，4-N，6-0-二乙酰胞壁质酶活力。前期研究发现本菌株产生溶菌酶含有多个组分，R1、R2和R3，对金黄色葡萄球菌及变形链球菌有溶解作用。本文采用随机鸟枪法构建基因文库，筛选溶菌酶基因，为今后溶菌酶基因组的研究奠定基础。限制性内切酶Sau3AI对灰色链霉菌RX-17基因组DNA进行不完全酶切，回收2-10kb的DNA片段；回收片段与经BamHI酶切、CIAP去磷酸化处理后的pUC19连接，构建重组质粒，转化E.coliDH5α感受态细胞；通过Amp抗性及α互补原理进行初筛，构建基因文库。灰色链霉菌溶菌酶对变形链球菌有着显著的溶解作用，因此用变形链球菌作底物用酶活测定的方法对文库进行筛选。25℃低温诱导对文库进行筛选，得到两株具有酶活的重组子。破碎细胞，20号重组菌株上清液SDS-PAGE电泳检测到24kD的重组蛋白，大小与溶菌酶组份R2相同；以primerA、primerB为引物PCR扩增，在有酶活的20号重组菌株扩增出一段大小为700kb左右的PCR片段，与溶菌酶R2基因片段大小接近；证实了在随机文库中筛选到R2基因。对于重组子的筛选还可以采用PCR检测的方法。根据共用引物和R1N末端设计的引物扩增到大小约1.3kb左右基因片段。

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作者
张晓东;
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作者单位

山东大学;

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授予单位山东大学;
学科微生物学
授予学位硕士
导师姓名张玉臻;
年度 2005
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类真细菌目;
关键词
灰色链霉菌; 基因文库; 基因扩增; 溶菌酶; 变形链球菌;

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