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弱毒疫苗中污染的禽腺病毒基因组分析及其与新城疫弱毒疫苗LaSota株的协同致病作用

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目录

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符号说明

前言

1.1禽腺病毒概述

1.2禽腺病毒的发现和分类

1.3禽腺病毒的生物学特点

1.3.1禽腺病毒的形态学特点

1.3.2禽腺病毒基因组构成

1.3.3 禽腺病毒的主要蛋白及功能

1.3.4禽腺病毒的复制过程

1.4禽腺病毒的流行病学

1.4.1禽腺病毒的流行情况

1.4.2禽腺病毒的传播途径

1.5禽腺病毒的主要临床症状和病理变化

1.5.1包涵体肝炎

1.5.2心包积水综合征

1.5.3肌胃糜烂症

1.5.4 呼吸道疾病

1.6禽腺病毒的诊断

1.6.1禽腺病毒分离与鉴定

1.6.2血清学检查

1.6.3分子生物学检测

1.7预防和控制措施

1.7.1预防措施

1.7.2免疫接种

1.8研究的目的和意义

2材料和方法

2.1材料

2.1.1毒株来源

2.1.2疫苗来源

2.1.3试验动物与饲养设施

2.1.4主要仪器

2.1.5主要试剂

2.1.6其他试剂的配制

2.2禽腺病毒FAdV-N22 株的全基因组测序

2.2.1禽腺病毒的增殖

2.2.2病毒基因组的提取

2.2.3引物的设计与合成

2.2.4 FAdV的PCR扩增

2.2.5 PCR扩增产物的回收纯化

2.2.6 回收产物的连接

2.2.7 感受态细胞的制备

2.2.8连接产物的转化

2.2.9阳性菌液的挑选和测序

2.2.10 FAdV全基因组分析

2.3新城疫弱毒疫苗LaSota株和FAdV-4在鸡体内的协同致病作用

2.3.1禽腺病毒增殖与定量

2.3.2 动物实验分组设计

2.3.3 不同组别生长情况和免疫器官指数

2.3.4不同组别血液中FAdV的病毒载量

2.3.5 ND抗体滴度的测定

3结果与分析

3.1禽腺病毒FAdV-N22 株的全基因组分析

3.1.1禽腺病毒FAdV-N22 株的全基因组序列扩增

3.1.2禽腺病毒FAdV-N22 株病毒基因组序列分析

3.2新城疫弱毒疫苗LaSota株和FAdV-4在鸡体内的协同致病作用

3.2.1不同处理组SPF鸡死亡率和心包积液综合征发生情况

3.1.2不同处理组SPF鸡生长情况

3.1.3不同处理方式对SPF鸡免疫器官指数的影响

3.1.4免疫LaSota疫苗提升了FAdV在血液中的病毒载量水平

3.1.5 不同处理对新城疫抗体水平的影响

讨论

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

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摘要

禽腺病毒(Fowl Adenovirus,FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属,是鸡、鸭等禽体内常见的传染性病毒。根据不同的特异性抗原将FAdV分为3个群,目前鸡群中主要流行Ⅰ亚群FAdV。2013年以来,在我国山东、河南等省的部分地区鸡群中发生了以心包积液和包涵体肝炎为特征的鸡心包积液-肝炎综合征,大量流行病学调查证实该病病原为Ⅰ亚群血清4型的FAdV(FAdV-4)。究竟是什么原因造成了FAdV-4的在我国的流行和爆发目前还没有确切的定论,本实验前期研究在鸡新城疫弱毒中鉴定到FAdV-4的污染,推测疫苗污染可能是该病传播的重要原因之一。那么弱毒疫苗中污染的FAdV-4与流行毒株是否一致?其基因组特点是怎样的?FAdV广泛存在于多种禽类的消化道和呼吸道中,可保持潜伏感染,一般情况下不表现发病,但是当受到应激或者有其他病原存在时便很容易出现症状,在生产中我们发现某些疑似感染FAdV的鸡群在免疫鸡新城疫弱毒疫苗等疫苗后反而出现发病,弱毒疫苗免疫对FAdV在体内的发病存在何种影响?针对上述问题,本研究在解析FAdV-4疫苗污染株基因组基础上通过系统的动物实验观察了新城疫弱毒疫苗LaSota株与FAdV在鸡体内的协同致病作用。 为了研究弱毒疫苗中污染的FAdV-4分离株的全基因组特点,本研究通过扩增测序得到了全基因组序列后,应用MEGA、Editseq等生物信息学软件对FAdV-N22分离株的遗传进化关系以及编码区部分序列进行分析。结果显示,该毒株共有43段蛋白质编码区(CDS),全基因组遗传进化树显示与血清4型属于同一分支,并且分析Hexon、Fiber1、Fiber2和Penton这些基因和其他毒株之间的差异。其中,Hexon的基因同源性为98.5%-99.9%,Fiber1的基因同源性为95.9%-99.8%,Fiber2的基因同源性为96.8%-99.7%,Penton的基因同源性达到了99.2%-99.6%,并且系统进化树分析显示,该毒株与国内流行的SD1601、NIVD2、GX-1等毒株具有极高的同源性,同时处于同一进化分支。为观察垂直传播感染的FAdV-4和新城疫弱毒疫苗在体内存的协同致病作用,本研究随机选择50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种模拟FAdV-4垂直传播感染,同时选取等量SPF鸡胚通过相同方式接种PBS用作对照。待孵化出雏后,于接毒组和对照组各取20只SPF鸡于7日龄免疫新城疫IV系弱毒疫苗(LaSota株),同时各组其余鸡以相同方式接种等量PBS作为对照。结果显示FAdV-4感染的雏鸡在免疫LaSota株后更容易发生严重的生长抑制和免疫器官损伤,造成了更高的死亡率,说明免疫LaSota株能显著提升垂直传播感染的FAdV-4致病性。 本研究证明免疫LaSota弱毒疫苗后疫苗株与垂直传播感染的FAdV-4在鸡体内的协同作用不仅增强了FAdV-4对SPF鸡的致病力,对LaSota疫苗的免疫保护力也产生了一定的不良影响,提示我们对于疾病的控制不能仅仅依赖疫苗免疫,还要加强对种源的疾病净化。

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