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先天感染ALV-J对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响及不同马立克病疫苗的分子鉴别

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目录

声明

符 号 说 明

1 前 言

1.1 鸡马立克病(MD)的研究进展

1.1.1 MDV分类及病原学特点

1.1.2 MDV的基因组结构

1.1.3 MDV特有基因(1)meq基因

1.1.4 MDV的发病机理

1.1.5 MDV的免疫抑制

1.1.6 流行病学

1.1.7 临床症状及病理变化

1.1.8 诊断技术

1.1.9 MD疫苗的研究进展

1.2 禽白血病(AL)的研究进展

1.2.1 病原学特点

1.2.2 流行病学特征

1.2.3 免疫抑制机制与致病性

1.3 MDV与ALV混合感染

1.4 本研究的目的和意义

1.4.1 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响

1.4.2 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立

2 材料和方法

2.1 试验材料

2.1.1 病毒

2.1.2 疫苗与质粒

2.1.3 主要试剂与仪器

2.1.4 其他试剂的配制

2.1.5 试验动物与SPF饲养设施

2.2 方法

2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备

2.2.2 MDV的增殖与定量

2.2.3 ALV的增殖与定量

2.2.4 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响

2.2.5 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立

3 试验结果

3.1 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响

3.1.1 MDV毒株GX0101以及ALV-J毒株 NX0101含量测定结果

3.1.2 SPF鸡的死亡率及肿瘤发生率

3.1.3 SPF鸡各组体重

3.1.4 SPF鸡 AIV-H9疫苗免疫后抗体水平测定

3.1.5 SPF鸡NDV疫苗免疫后抗体水平测定

3.1.6 SPF鸡中枢免疫器官指数

3.1.7 SPF鸡GX0101病毒增殖动态

3.2 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立

3.2.1 PCR方法对MDV meq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果

3.2.2 核酸斑点杂交方法对MDV meq基因缺失疫苗SC9-1与商品化疫苗的鉴别结果

4 讨论

4.1 先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响

4.2 不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立

5 结论

参考文献

致谢

8 攻读学位期间发表论文情况

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摘要

鸡马立克病(Marek’s disease, MD)是由鸡马立克病病毒(Marek’s disease virus, MDV)引起的一种鸡上最常见的T淋巴细胞增生性疾病。疫苗免疫是防控MD的主要措施。目前,我国使用最广泛的是 CVI988/Rispens 疫苗。然而近年来,有的鸡群免疫CVI988/Rispens疫苗后仍有马立克病的发生,影响了我国养禽业的健康发展,造成经济损失。禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)是一种可以引起多种肿瘤性疾病的免疫抑制性病原,它主要通过垂直感染的方式进行传播。流行病学调查显示,MDV感染鸡群常伴发 ALV 等免疫抑制性病原的共感染, ALV 的先天感染有可能是造成免疫CVI988/Rispens疫苗鸡群仍发生MD的原因之一。为证实这一推论,本文通过动物试验人工模拟先天感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)探究对鸡马立克病疫苗免疫保护效果的影响。此外,针对本实验室研发的新型MD疫苗SC9-1株与市场其他疫苗株尚无特异性鉴别方法的问题,建立了区别SC9-1株与其他株MD疫苗的分子鉴别方法。 1.先天感染ALV-J对马立克病疫苗免疫保护效果的影响 为研究先天感染ALV-J对CVI988/Rispens疫苗免疫保护效果的影响,将200枚SPF鸡胚分为5组,每组40枚。第1、2组为先天感染ALV-J组,在6胚龄时通过卵黄囊途径接种500 TCID50 ALV-J NX0101株。出壳后,第1、2、3、5组鸡颈部皮下免疫CVI988/Rispens疫苗,6日龄对第2、3、4组鸡均以2000 PFU/只的剂量腹腔注射MDV超强毒GX0101。试验期间,观察并记录各组鸡的病变及死亡情况,统计死亡率和肿瘤发生率,对疑似马立克病特有的病变脏器做病理切片;MDV GX0101攻毒后第1、2、3、4、5、6周称量各组鸡的体重;所有鸡10日龄免疫禽流感、新城疫灭活苗,免疫后第3、4、5周检测相应抗体水平;在GX0101攻毒后第1周每组随机选取5只鸡进行剖检,选取胸腺和法氏囊测定免疫器官指数;第2、3、4组在GX0101攻毒后5、10、14、21、28天,每组各随机选取6只鸡采集抗凝血分离淋巴细胞提取DNA,利用荧光定量PCR方法检测GX0101的拷贝数。研究结果表明,先天感染ALV-J增加了 CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒鸡的死亡率和肿瘤率,2组死亡鸡中一只鸡肝脏出现肿瘤,1、2、3、4、5各组鸡的死亡率分别为:5.7%、20%、2.9%、37.1%、0%;先天感染ALV-J、CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡的体重与CVI988/Rispens免疫GX0101攻毒组鸡相比,体重显著降低(P<0.05),引起胸腺和法氏囊的萎缩,显著抑制AIV-H9、NDV抗体的产生,GX0101的拷贝数在第14、21、28天显著高于CVI988/Rispens免疫GX0101 攻毒组。因此,先天感染ALV-J降低了CVI988/Rispens疫苗的免疫保护效果,引起感染鸡的免疫抑制,增强了GX0101在鸡体内的复制水平以及致病性,这或许表明先天感染ALV是造成免疫CVI988/Rispens疫苗后鸡群仍发生MD的原因之一。 2.不同马立克病疫苗分子鉴别方法的建立 为了对马立克病病毒meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVT Fc-126株进行分子鉴别,根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对I型MDV meq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法区分SC9-1株与其他疫苗株。结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1297bp、1297bp目的片段,HVT Fc-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT Fc-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT Fc-126株均没有条带。同时,使用针对meq基因的探针进行核酸斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT Fc-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行核酸斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT Fc-126株均为阴性。因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和核酸斑点杂交方法可以有效区分SC9-1与市场其他MD疫苗株。

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