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多重PCR检测三种小麦病毒及小麦黄花叶病素全基因组序列分析

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缩略词表

摘要

1 前言

1.1 小麦黄花叶病毒研究进展

1.1.1 发生和危害

1.1.2 症状与寄主范围

1.1.3 传播介体及病害发生规律

1.1.4 基因组结构

1.2 中国小麦花叶病毒研究进展

1.2.1 发生和危害

1.2.2 症状与寄主范围

1.2.3 传播介体及病害发生规律

1.2.4 基因组结构

1.3 水稻黑条矮缩病毒研究进展

1.3.1 发生和危害

1.3.2 症状与寄主范围

1.3.3 传播介体及病害发生规律

1.3.4 基因组结构

1.4 植物病毒检测技术研究进展

1.4.1 生物学方法

1.4.2 血清学方法

1.4.3 电子显微镜方法

1.4.4 分子生物学方法

1.4.5 多重PCR技术研究进展

1.5 植物病毒的遗传变异

1.5.1 病毒的变异机制

1.5.2 突变

1.5.3 重组

1.5.4 重排

1.6 植物病毒种群遗传分析方法

1.6.1 序列比对

1.6.2 系统发育关系分析

1.7 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 菌株和质粒

2.1.3 生化及分子生物学试剂

2.1.4 寡聚核苷酸引物

2.1.5 主要实验仪器

2.2 试验方法

2.2.1 小麦三种病毒的检测

2.2.2 小麦黄花叶病毒全序列的测定

3 结果与分析

3.1 小麦三种病毒的检测

3.1.1 引物特异性分析

3.1.2 多重RT-PCR检测体系的建立及条件优化

3.1.3 单重RT-PCR和多重RT-PCR电泳检测结果

3.1.4 山东省田间样品的检测

3.2 小麦黄花叶病毒遗传结构分析

3.2.1 病毒基因组的扩增

3.2.2 病毒分离物的基因组结构

3.2.3 小麦黄花叶病毒分离物序列核苷酸、氨基酸—致率

3.2.4 重组分析

3.2.5 系统发育关系分析

3.2.6 遗传距离分析

4 讨论

4.1 三种小麦病毒的检测

4.2 小麦黄花叶病毒全基因组序列分析

5 结论

参考文献

附录

致谢

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摘要

黄淮海地区是我国重要的小麦种植区。病毒病尤其土传花叶病和绿矮病是危害小麦最严重的病害之一。在黄淮海地区引起土传花叶病的病原为小麦黄花叶病毒(Wheatyellow mosaic virus,WYMV)和中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV),这两种病毒都通过禾谷多黏菌(Polymyxa graminisL.)传播。引起绿矮病的病原为水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV),主要通过灰飞虱(Laode lphaxstriatellus)传播。
  植物病毒的快速检测对病毒病原鉴定、病害预警及防治起重要作用,同时研究病毒病的流行、病毒的变异及进化趋势对了解病毒病发生规律、病毒致病机理研究及抗病品种培育有重要意义。
  本研究以多重RT-PCR为基础,选取危害山东小麦的WYMV、CWMV和RBSDVCP基因设计特异性引物,以Actin为内参基因,建立了一套同步检测WYMV、CWMV和RBSDV的方法。同时,对检测体系进行优化,PCR反应体系主要参数最终确定为TaqDNA聚合酶浓度0.025 U/μL,dNTP浓度0.25 mmol/L;扩增条件最终选择:退火温度56℃,延伸时间60 s,循环次数30次。
  2013-2014年,对山东省17地市小麦病毒病发生情况调查后发现,在济南、东营、菏泽、莱芜和德州5地市未发现疑似样品,其余12地市共采集到165份样品。通过多重RT-PCR检测三种病毒的发生情况,结果表明:93份样品中含有WYMV,14份样品中含有CWMV,11份样品中含有RBSDV。WYMV主要分布在淄博、枣庄、泰安、烟台、济宁、日照、临沂、聊城及威海。首次在淄博、日照和聊城检测到WYMV。CWMV在烟台、威海等老病区发生严重,并且已经扩展到临沂地区。RBSDV在济宁和临沂地区有发生。烟台、威海和临沂存在WYMV和CWMV复合侵染,其中烟台和临沂以WYMV为主,威海以CWMV为主。济宁和临沂存在WYMV和RBSDV复合侵染,但均以WYMV为主。青岛、滨州和潍坊未检测到这三种病毒。
  为研究小麦黄花叶病毒的遗传多样性,本研究共获得17个WYMV分离物全基因组序列。序列分析发现:除去ploy(A),各分离物的RNA1均为7635 nt,开放阅读框(ORF)为7215 nt,编码2404个氨基酸;RNA2均为3651 nt,ORF为2712 nt,编码903个氨基酸。利用重组分析软件RDP分析发现分离物LY-1、LY-2、LY-3及LY-4的RNA1序列存在重组,Yamato、Yangzhou及本研究获得的QF-2、LY-2分离物的RNA2序列存在重组。依据WYMV RNA1和RNA2编码序列进行系统进化分析发现WYMV可分为两个组,日本Date和Kyowa分离物、中国Ya'an和Zhouzhi分离物及TA-2、LY-6、QF-4、LY-5分离物的RNA1归属于Ⅱ组,但日本的Date和Kyowa分离物、中国Zhouzhi分离物及TA-2分离物的RNA2归属于Ⅰ组中;与这些分离物不同的是,RZ分离物的RNA1在Ⅰ组,但RNA2在Ⅱ组。这表明分离物Date、Kyowa、Zhouzhi、TA-2及RZ可能存在基因组重排。

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