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酵母表面展示EtMic1蛋白不同结构域及其作为抗球虫活载体疫苗的研究

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鸡球虫病是由一种或多种艾美耳科、艾美耳属的球虫寄生于鸡的肠上皮细胞内所引起的寄生原虫病，是对养禽业造成巨大经济损失的疾病之一。目前，球虫病在养禽业的控制策略主要是采用抗球虫药、强毒活疫苗、减毒活疫苗。但他们自身存在的一些缺点使得鸡球虫病的预防未能达到理想的效果，因而研发廉价高效的新型疫苗已成为缓解养禽业亏损的当务之急，随着现代生物技术的不断提高，鸡球虫基因/DNA疫苗，及亚单位疫苗的研究越来越引起人们的重视，此类疫苗与活苗相比具有一定的优势，但其仍有很多局限性。而活载体疫苗具有免疫效力高、生产成本低及安全性能好等不可比拟的优势，为新型球虫疫苗的研发提供了重要方向。
　　首先筛选鉴定保护性蛋白质抗原是研制活载体疫苗的关键，柔嫩艾美耳球虫微线蛋白1(EtMic1)可以作为新型疫苗的候选抗原来阻断子孢子侵入宿主细胞。其次选择合适的传递载体对于研制活载体疫苗也是非常重要的。而在众多活载体疫苗传递系统中，酿酒酵母表面展示系统可作为一个独特的真核表达系统，适用于表达球虫抗原。酿酒酵母表面展示系统不仅具有疫苗传递的便利性，当接种酵母口服活疫苗时，酵母细胞壁还能增强机体先天性免疫。
　　因此，在本研究中，我们从SD-01株柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子总RNA中扩增并克隆了EtMIC1基因，并根据EtMIC1不同结构域将其分成3段:EtMIC1-Ⅰ包括Ⅰ-结构域、TSP-1和TSP-2结构域;EtMIC1-Ⅱ包括Ⅰ-结构域和5个TSP结构域;EtMIC1-Ⅲ包含TSP-2、TSP-3和TSP-4结构域。使用EBY100/pCTCON2酵母表面展示系统，构建3种包含有EtMic1不同结构域重组质粒，制备了口服活疫苗免疫雏鸡。实验动物分为7组，即未免疫未攻虫组（Ⅰ组）、未免疫攻虫组（Ⅱ组）、免疫EBY100组(Ⅲ组)、免疫EBY/pCT组（Ⅳ组）、免疫EBY/pCT-EtMic1-Ⅰ组（Ⅴ组）、免疫EBYpCT-EtMic1-Ⅱ组(Ⅵ组)和免疫EBY/pCT-EtMic1-Ⅲ组(Ⅶ组)，连续免疫28天后攻柔嫩艾美耳球虫，并通过评价体重增长、相对增重率、盲肠损伤计分、卵囊排出量、卵囊减少率、抗球虫指数、血清抗体水平和脾淋巴细胞转化能力，比较它们对柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护效率。结果显示，与对照组比较，免疫EBY/pCT-EtMic1-Ⅰ、EBY/pCT-EtMic1-Ⅱ和EBY/pCT-EtMic1-Ⅲ的实验组均显示出一定的免疫保护力，攻虫7天后相对增重率分别为83.31％，85.34％和90.82％;卵囊排出减少率分别74.39％、75.74％和79.01％;盲肠病变记分分别为1.74、1.69和1.20; ACI分别为164.91、167.44和177.82。实验结果显示三种含有EtMIC1不同结构域的重组质粒的口服活载体疫苗表现出了不同的免疫保护效率，同时在提高特异性抗体应答和脾细胞转化能力等方面均表现出显著的不同。酵母表面展示的EtMic1-Ⅲ与酵母表面展示的EtMic1-Ⅰ和EtMic1-Ⅱ相比提供了更好的免疫保护。由于该系统排除了抗生素抗性基因的污染，酿酒酵母的菌株EBY100可以很好的用作球虫抗原的传递系统。

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