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鸡胚和雏鸡接种ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液的致病性比较

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论文说明

符号及缩略词

摘要

1 引言

1.1 禽白血病及历史

1.2 病原学

1.2.1 病毒特征

1.2.2 理化及生长特性

1.2.3 病毒的分型

1.2.4 病毒结构

1.2.5 病毒的复制

1.2.6 病毒转录与翻译

1.3 J亚群禽白血病病毒的病原学特性

1.3.1 J亚群禽白血病病毒的致病性

1.3.2 致肿瘤机制

1.4 J亚群禽白血病病毒的流行病学

1.4.1 宿主及潜伏期

1.4.2 传播方式

1.4.3 免疫反应

1.5 J亚群禽白血病的临床症状

1.6 J亚群禽白血病病毒的诊断与检测

1.6.1 病毒的分离与鉴定

1.6.2 分子生物学技术对禽白血病病毒的检测

1.6.3 ALV-J抗体的ELISA检测

1.7 J亚群禽白血病病毒的防控措施

1.7.1 免疫接种

1.7.2 净化措施

1.8 REV、MDV与ALV-J共感染的研究概况

1.9 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 病料的来源和处理

2.1.2 SPF鸡胚

2.1.3 细胞培养所用的试剂及DF-1细胞来源

2.1.4 单克隆抗体

2.1.5 异硫氰酸荧光素(FITC)所标记的羊抗鼠二抗

2.1.6 ALV抗原、抗体ELISA检测试剂盒

2.1.7 主要实验设备

2.2 方法

2.2.1 CEF细胞的制备

2.2.2 急性肉瘤浸出液中ALV-J的间接免疫荧光鉴定

2.2.3 ALV-J急性肉瘤浸出液TCID50的测定

2.2.4 人工造病试验

2.2.5 ALV特异性p27抗原以及病毒血症的检测

2.2.6 雏鸡血常规的检测

2.2.7 雏鸡的疫苗免疫及疫苗抗体效价检测

2.2.8 ALV-J抗体的检测

2.2.9 死亡鸡胚和雏鸡大体病变的观察

2.2.10 病理组织学切片的制备

2.2.11 免疫器官发育的检测

2.2.12 统计学分析

3 结果与分析

3.1 急性纤维肉瘤浸出液中ALV-J的IFA鉴定结果

3.2 急性纤维肉瘤浸出液中ALV-J的TCID50检测结果

3.3 不同部位接种急性肉瘤浸出液对鸡胚的致肿瘤性

3.4 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡生长的影响

3.5 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡的致肿瘤性

3.6 不同部位接种急性肉瘤浸出液的雏鸡病毒血症及泄殖腔p27动态

3.7 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡白细胞数的影响

3.8 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡NDV-HI抗体滴度的影响

3.9 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡H9-HI抗体滴度的影响

3.10 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡H5-HI抗体滴度的影响

3.11 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡ALV-J抗体的影响

3.12 不同部位接种急性纤维肉瘤浸出液对雏鸡免疫器官的影响

3.13 发病SPF鸡胚及雏鸡肉眼病变及其病理组织学观察

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

8 个人简介

9 硕士期间发表和待发表的论文

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摘要

J亚群禽白血病病毒是1988年首先从英国的肉鸡体内分离得到的,近二十五年以来给全世界的养禽行业,特别是肉鸡的养殖造成了极大的危害,经济损失无法估计。与传统的ALV-A、ALV-B相似,大多数ALV-J能够引起鸡的潜伏期漫长发病率低下的慢性肿瘤。2010年本实验室刘绍琼、王鑫等先后从30日龄的817肉杂鸡和开产后的海兰褐蛋鸡体内各发现了一例由ALV-J引发的急性纤维肉瘤病例,在通过相应的试验验证病因后,李传龙等对817肉杂鸡中分离到的病毒在鸡体上展开了系统的研究,而本研究则注重研究海兰褐蛋鸡中分离到的这株ALV-J急性病毒,接种鸡胚以模拟更接近该病毒垂直传播的状态,对不同方式接种该ALV-J相关的急性纤维肉瘤浸出液的致病性进行比较。将ALV-J相关急性病毒引发的新一代急性纤维肉瘤与PBS按1∶6的质量体积比冰浴研磨,4℃,12000r离心5min,上清液0.22um滤器过滤后即为肿瘤浸出液,该浸出液接种于CEF细胞9天后,IFA验证其中的ALV-J的存在并测定其中ALV-J的TCID50。然后,分别于5日龄胚卵黄囊、11日龄胚绒毛尿囊膜、1日龄雏鸡腹腔接种急性纤维肉瘤浸出液,出壳后统计接毒鸡胚的肿瘤发生率和致死率,分别于1日龄、1-6周龄对各组每只鸡无菌采集抗凝血、泄殖腔棉拭子、称量体重,检测各组雏鸡带毒排毒状态。1周龄时,每只鸡免疫鸡新城疫、禽流感病毒H5亚型、禽流感病毒H9亚型疫苗,4-6周龄时每只鸡采集血清,测定各疫苗抗体滴度、ALV-J抗体水平以及6周时各组雏鸡免疫器官指数,并对1-6周内死亡鸡只进行剖检观察大体病变和病理学变化。
   结果表明,5日龄卵黄囊接种的鸡胚在18-22日龄死胚率为14/30,肿瘤发生率为8/14;11日龄绒毛尿囊膜接种的鸡胚在18-22日龄引起鸡胚死亡率为17/30,肿瘤发生率为6/17。雏鸡病毒血症及泄殖腔棉拭子p27动态观察发现,尿囊膜接毒不仅可以造成雏鸡的高死亡率(100%),而且病毒血症和泄殖腔排毒均为100%;随着周龄增大,其余两个接毒组的雏鸡病毒血症和泄殖腔排毒也在不断变化,卵黄囊接毒组到3周龄时病毒血症的检出率也可达到100%,而1日龄腹腔接毒组直到4周龄时病毒血症才达到最高的75%,这两组泄殖腔p27棉试子的检出率最高时也分别只有70%(4-6周龄时)和41.2%(1周龄)。对雏鸡的致病性比较表明,绒毛尿囊膜接种的13只出壳雏鸡全部死亡,有11只出现肿瘤。
   连续三周采血检测新城疫、禽流感H5和H9三种病毒的抗体滴度发现,该ALV-J相关急性肿瘤病毒对这三种疫苗有不同程度的免疫抑制作用,都能使疫苗的免疫效果降低。通过比较6周龄时各组雏鸡的免疫器官指数发现,该病毒能显著地抑制法氏囊的发育,而且血常规检查也发现三个接毒组的雏鸡在发病临近死亡时血液中的白细胞数显著地减少。
   病理组织学观察显示,三种接毒方式均可以引起雏鸡腹腔积存与肉瘤的发生密切相关的淡红色粘液;肝脏发生肿瘤,表现为肉瘤和血管瘤;而且在一定时间内,随着感染时间的延长,病死雏鸡发生肿瘤的部位增多,肿瘤越明显。
   结果提示,海兰褐蛋鸡分离株ALV-J相关急性纤维肉瘤浸出液对鸡胚和雏鸡均有致瘤作用。不同接种方式的致病机制不完全相同。绒毛尿囊膜接种的致病性不仅高于卵黄囊接种,也高于1日龄雏鸡接种。不仅肿瘤发生率高,且发生更早更快,可作为该急性纤维肉瘤进一步作人工造病的实验模型。

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