HIV膜融合抑制剂HR212表达、免疫原性检测及与5-helix病毒融合抑制的初步研究

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艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的人类免疫缺陷综合症。目前FDA批准的用于临床的抗HIV的药物只是逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，这两类药物在艾滋病的治疗方面已经取得了巨大的进展。但由于病毒基因的变异，导致了耐药株的出现，导致常规治疗方案失效。因此研究新的抑制剂对于抑制HIV病毒在体内的复制具有重要意义。 HR212是由本实验室构建的一种膜融合抑制剂，前期研究证实此蛋白能够有效的抑制HIV-1假病毒感染细胞，并且其结构稳定，能耐受蛋白酶酶切作用。此蛋白具有和T20相似的抗病毒活性，且能够对T20耐药株也具有良好的抑制效果。HR212除了能够抑制HIV-1外，还对HIV-2具有部分抑制效果。前期HR212是以融合表达的形式进行表达的，由于其氨基端存在非目的片段，故不能正确表明其膜融合性质。为向将来的药物临床应用提供资料，我们拟非融合表达了HR212，同时也检测HR212的免疫原性。将HR212基因连接于pBV220上，经诱导表达、纯化后免疫小鼠。经间接ELISA验证HR212按照传统方法免疫能够得到抗体滴度，而以10倍治疗剂量按照治疗程序多次注射时，却仅在1/1000时检测到抗体滴度，此结果为下一步降低其免疫原性的方法探讨具有重要意义。此外，为了研制治疗性疫苗，我们构建了HR212的腺病毒表达体系。通过将HR212连接到穿梭质粒pDC315上，然后与骨架质粒共转染239细胞，经过7天后获得具有复制缺陷的重组腺病毒rAd-TPA-HR212。经Western Blot验证，成功得到了13.3 kd的目的蛋白。经假病毒抑制试验证实，经腺病毒表达的HR212能有效的抑制假病毒介导的膜融合过程。为下一步研究奠定了基础。人工构建的五螺旋蛋白(5-helix)能够抑制HIV介导的膜融合过程中发卡三聚体的形成，从而抑制病毒感染靶细胞。但5-helix基因在原核细胞中直接表达时易形成包涵体，复性困难，给研究带来不便。通过同源建模，模拟了5-helix在pGEX-6P-1载体及pET44b载体上的融合蛋白形成的最有可能的两种构象。通过对比发现，其在pET44b载体中与NusA的融和蛋白的溶剂化能远大于在pGEX-6P-1中的GST蛋白，并且酶切位点位于蛋白表面。因此我们将HR212连接于pET44b上，构建重组载体pET44b-PSP-5Helix，经转化、诱导、纯化后，经HIV假病毒抑制试验证明，此蛋白具有明显的抑制HIV假病毒的活性。

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作者
王久强;
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作者单位

山东农业大学;

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授予单位山东农业大学;
学科基础兽医学
授予学位硕士
导师姓名刘思当;
年度 2009
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类病毒病;
关键词
人免疫缺陷病毒; 艾滋病; 抑制剂; 病毒融合;

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