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嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达

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第一章文献综述

第二章嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)热稳定性糖化酶的纯化及特性

第三章嗜热毛壳菌热稳定性糖化酶基因的cDNA克隆及其序列分析

1.材料和方法

2.结果与分析

3.讨论

第四章Chaetomium thermophilum热稳定糖化酶基因在毕赤酵母中的表达

第五章结论和建议

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况

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摘要

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系统命名为淀粉α-1.4-葡聚糖葡萄糖水解酶，α-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3)]，是一种具有外切活性的酶，它能把淀粉、糊精、糖原等从非还原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷键，而得到终产物β-D-葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6-葡萄糖苷键，转化为葡萄糖，是淀粉转化为葡萄糖过程中的主要酶类之一。糖化酶具有重要商业价值，凡对淀粉、糊精、低聚糖进行酶水解的工业上，都可适用。尽管糖化酶对α-1.6-糖苷键的活性只有α-1.4-糖苷键的0.2％，这足以在工业糖化过程中影响产量。这一特性及在其他方面的需求产生现在研究人员对糖化酶的目标特定的蛋白质工程研究。 目前国内外已筛选出多种糖化酶生产菌，并将其分离提纯。但市场应用的糖化酶主要来源于常温菌，因产品成本高，热稳定性差，储存期短，酶活力和产率低而制约糖化酶在农业、工业上的应用。由此可见，热稳定性糖化酶的研究和开发具有重要的商业价值。 嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)是一种广泛分布的，生长上限温度较高的嗜热真菌，从该菌中已分离了多种嗜热酶，但未见该菌嗜热糖化酶的报道。本研究中C.thermophilum在以可溶性淀粉为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了糖化酶，通过硫酸铵沉淀、DEAE-SepharoseFastFlow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的糖化酶。SDS-PAGE测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为64kDa。 该酶的最适反应温度和pH分别为65℃和4.0。在pH4.5条件下，该酶在50℃以下稳定，70℃的半衰期为20min。Ca2+，Mg2+，Na+，K+对酶有激活作用，一些重金属离子Fe2+，Ag+，Hg2+对酶有显著的抑制作用。该糖化酶是一种糖蛋白，含糖量为11.7％。C.thermophilum热稳定糖化酶的N-端15个氨基酸序列为Ala-Val-Asp-Ser-Tyr-Ile-Glu-Arg-Glu-Thr-Pro-Ile-Ala-Trp-Asn，与Neurosporacrassa，Humicolagrisea和Thielaviaterrestris糖化酶的N-端氨基酸序列有较高的同源性。 根据C.thermophilum热稳定糖化酶的N-端氨基酸序列和同源保守序列设计简并引物，通过RT-PCR及快速扩增cDNA末端(RACE)的方法，克隆了该糖化酶的编码基因gla，全长cDNA为2016bp，包含一个由599个氨基酸组成的开放阅读框。该基因已在Genbank中注册，登录号为DQ104609。 由核苷酸序列推导的相应氨基酸序列N-端前30个氨基酸为信号肽序列，完全去除信号肽后，N端氨基酸序列与测定的纯酶N端序列完全一致。比较糖化酶的催化区序列，发现与15家族糖化酶的同源性很高，在催化区中有五个基序P-YFY-W-RDAAL、WG-PQRDGP、D-WEEV、AVG-Y-ED和L-W-YA非常保守。这些保守基序与糖基水解酶(glycosylhydrolases)15家族催化活性有关。vgla基因和酵母分泌型表达载体pPIC9K双酶切后体外连接，构建酵母重组表达载体pPIC9K/gla并测序，保证正确的阅读框。将重组表达质粒pPIC9K/gla和pPIC9K空质粒分别用限制性内切酶SacⅠ(位于5'AOX1区内)线性化后，采用电击法转化PichiapastorisGS115酵母感受态细胞，于MD/MM平板上筛选His+Mut+表型的酵母转化子。经过PCR检测及G418抗性筛选多拷贝整合子，进行甲醇诱导培养。通过检测各转化子每隔24h的蛋白表达情况来筛选高效表达目的糖化酶的工程菌株。筛选到表达酶活性最高的菌株GS-GLA-22，甲醇诱导6d酶活性达到最高，达16.73U/mL，酶蛋白表达量为0.86mg/mL。检测目的蛋白的表达量及遗传稳定性，并测定表达糖化酶的酶学性质。 酵母工程菌株GS-GLA-22在YPD平板上划线，连续传代10次后，PCR检测呈阳性，重组糖化酶的表达量基本保持稳定。表达糖化酶GLA的最适反应温度和pH分别为65℃和4.5～5.0，该酶在60℃以下稳定；65℃的半衰期为40min；在pH值为2.5～7.0之间表达糖化酶保持稳定的酶活性；Fe2+、Mg2+、Ca2+、K+、Na+对酶有激活作用，一些重金属离子Ag+、Hg2+对酶有显著的抑制作用。 C.thermophilum糖化酶能在毕赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表达产物同样具有原始菌株C.thermophilum糖化酶的优良特性，这就预示了表达糖化酶在制糖工业和生物学领域的广阔应用前景。因此，期望能对该基因进行改造，或进一步优化表达条件，获得真正有工业应用价值的酵母工程菌株。

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