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葡萄糖氧化酶(GO)基因在番茄中的遗传转化及其抗病机理研究

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第一章引言

1植物抗病的物质基础及抗病机理研究进展

1.1病原致病作用

1.2植物的抗病机制

1.3抗病反应的物质基础

1.4活性氧的种类及其作用

1.5植物-病原互作中AOS的产生

1.6活性氧的清除系统

1.7 H2O2与植物抗病反应及抗病信号转导

1.8提高植物抗氧化能力的基因工程

2番茄基因工程研究进展

2.1番茄抗虫基因工程进展

2.2番茄抗病害基因工程进展

2.3番茄基因工程育种前景与展望

3葡萄糖氧化酶基因在植物育种中的应用

3.1葡萄糖氧化酶基因的来源

3.2 H2O2在植物抗病中的作用

3.3 GO基因在植物抗病育种中的应用

4本研究的目的和意义

第二章番茄组织培养及其高频遗传转化体系的优化

1材料和方法

1.1试验材料

1.2试验方法

2结果与分析

2.1外植体接种后形态变化

2.2不同激素组合对愈伤组织及芽形成的影响

2.3ZT+IAA不同浓度组合对不定芽分化数目和生长的影响

2.4 组合对不同番茄自交系愈伤组织和不定芽形成的影响

2.5不同激素配比对番茄再生植株生根的影响

2.6农杆菌侵染条件的优化

2.7PPT和Cb对番茄子叶外植体再生能力的影响

2.8试管苗的移栽结果

3讨论

3.1外源激素对番茄组织培养体系建立的影响

3.2基因型对番茄组织培养体系建立的影响

3.3关于番茄遗传转化体系的优化

3.4关于再生芽的生根问题

3.5番茄外植体再生途径实现的探讨

第三章植物表达载体的构建及在番茄中的遗传表达

1实验材料

1.1植物材料

1.2菌株和质粒

1.3分子生物学及生化试剂

1.4 PCR引物

1.5培养基

1.6植物表达载体的构建

1.7植物表达载体pCPGO导入土壤农杆菌

1.8外植体的准备

1.9侵染农杆菌的制备

1.10不同品系番茄转化及植株再生

1.11再生植株的PCR检测

1.12转基因番茄的Southern杂交

1.13转基因番茄的Northern杂交

1.14转基因番茄植株中H2O2的定性及定量检

1.15转基因番茄的抗病性鉴定

2结果与讨论

2.1植物表达载体的构建

2.2植物表达载体pCPGO的鉴定

2.3番茄的遗传转化

2.4转基因植株总DNA的PCR检测

2.5转基因番茄的Southern杂交分析

2.6转基因番茄的Northern杂交分析

2.7转基因番茄GO基因表达的定性和定量检测

2.8种子结实率和萌发率的测定

2.9转基因植株的抗病性鉴定

3讨论

第四章葡萄糖氧化酶(GO)基因的抗病生理生化变化

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1 SOD酶和POD酶活性的变化

2.2 CAT酶活性的变化

2.3 PAL酶活性变化

2.4 PPO活性变化

2.5 APX活性变化

2.6同工酶酶谱分析

2.7抗病性鉴定结果分析

3讨论

第五章转GO基因番茄后代遗传研究

1材料与方法

1.1材料

1.2方法

2结果与分析

2.1转基因番茄自交后代遗传分离

2.2 GO基因在杂交后代遗传分离

2.3分子检测

3讨论

第六章结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

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摘要

植物在抵御病原侵染时产生一系列的防御机制。在病原侵染的位点上坏死斑的形成与诸如细胞壁的加强、植保素合成及病程相关蛋白的积累等的防御反应相关联。在植物和病原菌的相互作用中,最早响应之一是O2-、OH-和H2O2等活性氧的大量急剧产生,而且这种活性氧的进发被假设是由超敏反应介导的。活性氧不仅具有直接杀死病原菌的作用,而且作为信号分子诱导防御系统基因的表达,并最终诱导系统产生获得性抗性。 本研究构建了由病原诱导启动子驱动的来自于黑曲霉的GO基因植物表达载体pCPGO,通过农杆菌介导,采用叶盘法进行番茄5个自交系的遗传转化,获得了58株转基因植株。经PCR检测和Southern杂交分析证明GO基因已整合到番茄基因组中。Northern杂交结果表明GO基因在转录水平上已经表达。而且通过H2O2定性和定量检测证明了GO基因的表达。所有转基因植株的结实率都有不同程度的减少,转基因番茄种子萌发率均有不同程度的降低。转基因植株的抗病性鉴定结果表明,所有转化株系均不同程度的增强了对番茄叶霉病和晚疫病的抗病性,表现出对病原菌的广谱抗病性。且叶霉病发病的轻重与H2O2量有密切的相关性。

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