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【6h】

DjMDF基因在日本三角涡虫肌肉再生过程中的作用

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第一章 综 述

1 涡虫概述

2 肌肉发生概述

3 涡虫RNA干扰作用

4 转染作用

5 选题的研究意义

第二章DjMDF基因干扰作用

1前言

2实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

第三章 DjMDF基因干扰表达分析

1前言

2实验材料

3实验方法

4实验结果

第四章DjMDF基因转染

1前言

2实验材料

3 实验方法

4 实验结果

5 讨论

结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的文章

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摘要

涡虫是扁形动物门(Platyhelminthes)涡虫纲(Turbellaria)动物。涡虫具有惊人的再生能力,早在1989年,Morgan等就已发现即使将涡虫切成279段,其每一截段也可以再生成一个完整的个体,证实了涡虫强大地再生能力。除此之外,涡虫作为具有三胚层、两侧对称、头部集中化等特性的最简单生物体,在后生动物的进化过程中占据重要地位。在过去的一个世纪里,涡虫作为经典的模式生物,为后生动物乃至人类生物学难题的解答提供了重要的参考依据,尤其是涡虫再生机制的研究,对于脊椎动物再生模型的建立具有重要意义。 本文主要对于涡虫的DjMDF基因的表达情况进行研究,首先是进行DjMDF基因的RNA干扰实验:涡虫的DjMDF基因与PPR-240干扰载体相连,DjMDF基因片段插入位点的两端各有一个T7启动子,T7启动子为RNA转录合成启动子,能够诱导RNA片段的合成。当含DjMDF基因的PPR-240重组载体转入大肠杆菌HT115菌种后,在IPTG的诱导作用下,启动基因片段两侧的T7启动子,以DjMDF基因片段的两条链为模板合成dsRNA。其中大肠杆菌HT115为一种工程菌,该菌株发生了RNA酶基因的诱变作用,菌种中不含有RNA酶,因此新形成dsRNA能够长期储存在HT115大肠杆菌中,而不会被降解。用含有dsRNA的HT115大肠杆菌与胎牛肝做成食物饲喂涡虫,dsRNA会随食物的消化作用进入涡虫细胞中,在涡虫体内引发基因沉默作用。 利用整体原位杂交技术对于涡虫DjMDF基因的干扰效果进行检测,干扰组涡虫横切为三段后,其头段、中段、尾段中的DjMDF表达的整体趋势、表达部位与正常涡虫相同:再生36h时,表达量达到最大值,之后随着再生时间段的延长表达量逐渐减弱;其中DjMDF的表达量与正常涡虫相比,在每个再生时间段内都有明显的减少,但是DjMDF基因的表达区域并没有完全消失。该结果说明饲喂含DjMDF片段的HT115-PPR240重组菌会引发涡虫体内DjMDF基因的干扰作用,使DjMDF的表达量减少,但不能介导DjMDF基因彻底的沉默作用。 转染实验首先通过PCR技术得到DjMDF基因和小鼠MyoD基因ORF区克隆片段,将克隆片段分别与LV-EF1α-IRES-EGFP表达载体相连形成LV-DjMDF、LV-MyoD重组载体,以重组载体和包装载体vsv-g、δ8.91为基础进行慢病毒的包装作用,再用慢病毒侵染293T细胞,从而将DjMDF基因和小鼠MyoD基因转染入293T细胞中,进行GFP荧光显微镜检测和FASC检测,结果表明LV-DjMDF、LV-MyoD重组载体在293T细胞中都能够正常的转录表达,但是Western Blot检测结果显示小鼠MyoD基因在293T细胞中成功表达了MyoD蛋白,而涡虫DjMDF基因在293T细胞中没有表达。分析原因可能是涡虫与人的亲缘关系太远,物种差异性太大,导致tRNA丰度不同,因此无法转录表达DjMDF蛋白。 本文实验主要是对于涡虫DjMDF基因进行研究,确定DjMDF基因在涡虫再生中的作用,为无脊椎动物再生模型的建立提供基础资料。

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