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基于Wnt/β-Catenin信号通路的补肾活血胶囊治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究

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摘要

目的： 1.通过临床疗效评价方法和影像学评价方法，观察补肾活血胶囊治疗激素性股骨头坏死的临床疗效。 2.通过补肾活血胶囊对SD大鼠激素性股骨头坏死组织和体内外骨髓间充质干细胞的干预，以及检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子（Wnts、β-Catenin）及其下游促增殖（CyclinD1）、成骨-成脂分化(Runx2、Osterix、PPARγ）、血管内皮生长因子(VEGF)等特异性转录因子的基因和蛋白表达情况，探讨补肾活血胶囊基于Wnt/β-Catenin信号通路促进激素性股骨头坏死骨修复机制。 方法： 1.临床研究：2015年9月至2016年10月在山东中医药大学附属医院骨科门诊就诊的ARCO分期I、II期激素性股骨头坏死患者80例，随机分为对照组和治疗组，每组40例。对照组给与仙灵骨葆治疗，治疗组给与补肾活血胶囊治疗，分别于治疗前及治疗后3个月、6个月、9个月和12个月采用临床评价方法（Harris量表、WOMAC量表）和影像学评价方法（股骨头坏死面积评价、股骨头塌陷评价法）及肝肾功能检测评估补肾活血胶囊治疗早期激素性股骨头坏死的临床疗效及药物安全性。 2.动物实验研究：1）在体实验：120只SD大鼠，随机分为对照组、模型组和治疗组，每组各40只。模型组给予地塞米松磷酸钠臀肌注射。治疗组同时给于补肾活血汤灌胃干预，其它两组采用生理盐水干预。6周后各组随机取5只大鼠股骨头用于HE染色动态观察各组股骨头变化及造模情况。12周后给予所有大鼠处死获取标本（血液、股骨头组织、骨髓间充质干细胞）用于检测。通过血生化检测（TC、TG、Ca、ALP）及HE染色观察各组股骨头坏死及修复情况；通过RT-PCR和Western Blot检测股骨头组织上述相同时间点Wnt/β-Catenin信号通路主要因子及其下游成骨-成脂、成血管分化等特异性转录因子（Wnt10b、β-Catenin、Runx2、Osterix、PPAR-γ、VEGF）基因和蛋白表达水平；通过CCK-8、茜素红染色、油红O染色、ALP定量检测三组大鼠P3代骨髓间充质干细胞增殖功能变化和经典成骨、成脂诱导剂诱导后rBMSCs成骨-成脂分化功能变化情况，并通过RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及其下游促增殖、成骨-成脂分化特异性转录因子（Wnt3a、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix、PPAR-γ）蛋白和基因表达水平，从组织、细胞、蛋白、核酸层面揭示和探讨补肾活血胶囊基于Wnt/β-Catenin信号通路促进激素性股骨头坏死骨修复机制。 2）离体实验：采用体外分离、培养、纯化、鉴定SD大鼠BMSCs，P3代用于实验，给予10-6mol/L地塞米松磷酸钠及不同梯度浓度的补肾活血汤含药血清干预分为对照组、低浓度含药血清组、中浓度含药血清组、高浓度含药血清组、激素组、低浓度含药血清+激素组、中浓度含药血清+激素组、高浓度含药血清+激素组八组，通过CCK-8、茜素红染色、ALP定量检测、RT-PCR、Western Blot等方法检测rBMSCs增殖、成骨分化情况及Wnt/β-Catenin信号通路核心蛋白、成骨-成脂分化特异性转录因子（β-Catenin、Runx2、PPAR-γ）基因和蛋白表达水平，进一步揭示和探讨补肾活血胶囊基于Wnt/β-Catenin信号通路对体外大剂量激素干预的rBMSCs成骨-成脂分化功能影响。 结果： 1.临床实验结果： Harris量表、WOMAC量表评分结果显示两组患者在治疗前差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者治疗后组间比较：治疗后3个月差异无统计学意义（P＞0.05）；随后6个月、9个月及12个月差异有统计学意义（P＜0.05）；组内比较：对照组、治疗组患者治疗后3个月、6个月、9个月、12个月较治疗前比较结果差异均有统计学意义（P＜0.05）。两组患者在治疗前MRI计算坏死面积结果差异无统计学意义（P＞0.05）。两组患者在治疗后3个月、6个月、9个月、12个月组间及组内比较MRI计算坏死面积结果差异无统计学意义（P＞0.05）。股骨头塌陷评价法结果显示至实验结束治疗组21髋出现股骨头塌陷；对照组31髋出现股骨头塌陷,结果差异有统计学意义（P＜0.05）。股骨头塌陷曲线结果显示，治疗组的股骨头中位塌陷时间为9个月大于对照组6个月，Log-rank检验P＜0.05,有统计学意义。肝功能、肾功能检测无明显损害。 2.动物实验结果： 1）在体实验结果： （1）血生化指标检测结果 模型组与对照组相比，血TC、TG上调明显，血Ca、ALP下调明显，有统计学意义（P＜0.05）；治疗组与模型组相比，血TC、TG下调明显，血Ca、ALP上调明显，有统计学意义（P＜0.05）。 （2）股骨头组织检测结果 ①HE染色结果：模型组与对照组相比，骨小梁面积减少、脂肪空泡面积和空骨陷窝率增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）；治疗组与模型组相比，骨小梁面积增加，脂肪空泡面积和空骨陷窝率降低，差异均有有统计学意义（P＜0.05）。 ②RT-PCR和Western Blot结果：模型组与对照组相比，Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及下游成骨、成血管特异性转录因子（Wnt10b、β-Catenin、Runx2、Osterix、VEGF）的基因和蛋白表达下调（P＜0.05）；成脂特异性转录因子（PPAR-γ）的基因和蛋白表达上调（P＜0.05）。治疗组与模型组相比，Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及下游成骨、成血管特异性转录因子（Wnt10b、β-Catenin、Runx2、Osterix、VEGF）的基因和蛋白表达上调（P＜0.05）；成脂特异性转录因子（PPAR-γ）的基因和蛋白表达下调（P＜0.05）。 （3）三组大鼠BMSCs功能检测结果 ①体外培养表面抗原鉴定结果：三组大鼠P3代rBMSCs表面抗原FITC单染结果表明，模型组各表面抗原（CD45、CD73、CD90、CD105）较对照组差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组各表面抗原较模型组差异有统计学意义（P＜0.05）。 ②增殖情况检测结果：模型组与对照组相比，CCK-8检测细胞数量增殖结果及RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关蛋白及下游细胞周期蛋白（Wnt3a、β-Catenin、CyclinD1）基因和蛋白表达下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；治疗组与模型组相比，CCK-8检测细胞数量增殖结果及RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关蛋白及下游细胞周期蛋白（Wnt3a、β-Catenin、CyclinD1）基因和蛋白表达上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。 2）离体实验结果： （1）CCK-8测增殖率结果：八组细胞增殖曲线除激素组外，其余七组细胞生长曲线呈“S”型。不同浓度的补肾活血方含药血清处理的rBMSCs增殖能力均强于对照组，不同浓度的补肾活血方含药血清和10-6mmol/L地塞米松磷酸钠干预的rBMSCs增殖能力均强于激素组（P＜0.05），并随浓度梯度的增高而增强。 （2）茜素红染色及定量、ALP定量检测结果：不同浓度的补肾活血方含药血清处理的rBMSCs茜素红染色及定量、ALP定量检测结果均高于对照组，不同浓度的补肾活血方含药血清和10-6mmol/L地塞米松磷酸钠干预的rBMSCs茜素红染色及定量、ALP定量检测结果均高于激素组（P＜0.05），并随浓度梯度的增高而增高。 结论： 1.临床研究结果表明，补肾活血胶囊对激素性股骨头坏死疗效显著，可以明显改善SONFH患者临床症状并延缓股骨头坏死塌陷时间，并无明显肝肾功能损害。 2.动物实验血生化及HE染色结果表明补肾活血胶囊能够促进SD大鼠激素性股骨头坏死骨组织修复。 3.补肾活血胶囊促进SD大鼠激素性股骨头坏死组织骨修复机制可能与调控体内Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子（Wnt10b、β-Catenin）及下游成骨-成脂分化相关特异性转录因子和血管内皮生长因子（Runx2、Osterix、PPAR-γ、VEGF）的基因和蛋白表达有关。 4.补肾活血胶囊促进体内外大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化，抑制成脂分化机制也可能与调控Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子（Wnts、β-Catenin）及下游成骨-成脂分化相关特异性转录因子和细胞周期蛋白D1（Runx2、Osterix、PPAR-γ、CyclinD1）的基因和蛋白表达有关。

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