病原真菌与噬蜡细菌降解日本龟蜡蚧蜡质的研究

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蚧虫属于昆虫纲(Insecta)、半翅目(Hemiptera)、蚧总科(Coccoidea)，在全世界记录7000余种，是农林果树和花卉的主要害虫。它们的最大特点是体壁具有多种蜡腺，能分泌大量蜡质，在虫体表面形成多种类型的蜡壳或蜡被，对虫体起保护作用，具有很强的生存优势，防治十分的困难。本研究以具有厚蜡壳的日本龟蜡蚧CeroplastesjaponicusGreen（蚧科Coccidae）作为蚧虫的代表，选择4株昆虫病原真菌（从蚧虫上分离的蜡蚧霉Lecaniciliiumlecanii菌株V3.4504、从褐飞虱分离的蜡蚧霉菌株V3.4505菌株、从帕克阿扁叶蜂幼虫分离的球孢白僵菌BeauveriabassianaVuillFDB01菌株、从桃小食心虫幼虫上分离的绿僵菌MetarhiziumanisopliaeTSL06菌株）和一株噬蜡细菌菌株(铜绿假单胞菌pseudomonasaeruginosa)。研究昆虫病原真菌和噬蜡细菌对蚧虫蜡质(单独蜡壳-waxcovering和“蜡壳+虫体”-waxcovering+insectbody)的降解作用和对蜡壳的入侵效果，这对于认识病原真菌对蚧虫的感染机理和开发高致病性病原真菌成为生物杀虫剂具有重要意义。
　　本文研究的内容与结果如下:
　　一、昆虫病原真菌对蚧虫蜡质的降解作用
　　 1.1用4株病原真菌孢子悬液浓度为2×107spore/mL感染日本龟蜡蚧雌成虫后，体视显微镜下观察病原真菌对日本龟蜡蚧雌成虫的致死效果，结果发现:染菌虫体蜡壳表面逐渐被菌丝覆盖，虫体干瘪死亡。对照虫体15d后蜡壳表面未见染菌，腹面湿润饱满，未死亡。15d后，4菌株对蚧虫雌成虫的致死率分别为TSL06(70.56±0.04％)＞V3.4504(68.33±0.06％)＞FDB01(67.22±0.07％)＞V3.4505（65.00±0.05％）。说明4株昆虫病原真菌都对蚧虫雌成虫具有较高的致死效果。
　　 1.2将日本龟蜡蚧雌成虫蜡质按0.4g/50mL的比例加入无机盐培养液中，制备成含蚧虫蜡质的无机盐培养液，将4菌株按5％的接菌量分别接入到蜡质无机盐培养液中，体视显微镜下观察病原真菌在蜡质+无机盐培养液中的生长状态，结果发现4菌株在该无机盐培养液中都能以日本龟蜡蚧蜡质作为营养碳源，进行生长、发育和繁殖。其中蜡蚧霉V3.4504和V3.4505菌株主要是以菌丝的形态存在，球孢白僵菌FDB01和绿僵菌TSL06菌株主要是以孢子和短棒状菌体的形态存在。这意味着病原真菌可能会以不同的形态方式入侵蚧虫蜡壳。
　　 1.3脂肪酶是病原真菌降解蜡质中化学成分的主要胞外酶。测定了蜡质无机盐培养液中4株病原真菌降解蚧虫蜡质过程中脂肪酶活性变化，结果显示，4菌株在连续7天降解蜡质过程中脂肪酶活性有不同的变化趋势，其中在降解蚧虫单独蜡壳试验组中，各菌株最大脂肪酶活性依次为TSL06（0.149±0.005U/mL）＞V3.4504(0.128±0.0017U/mL)＞FDB01(0.115±0.017U/mL)＞V3.4505(0.057±0.002U/mL);在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验组中，各菌株最大脂肪酶活性为TSL06(0.535±0.009U/mL)＞V3.4504(0.433±0.015U/mL)＞FDB01(0.426±0.082U/mL)＞V3.4505(0.289±0.003U/mL)。由此看出，TSL06、V3.4504和FDB01菌株的脂肪酶活性都明显高于V3.4505，它们对蚧虫蜡质降解能力可能会强于V3.4505。
　　 1.4微生物产生的脱氢酶是降解蜡质中长碳链化合物的主要酶类，通过活化石油烃的氢原子，并传递给特定的受氢体实现烃的氧化和转化。本文测定了4株真菌在降解蚧虫蜡质过程中的脱氢酶活性变化，结果显示，4菌株在连续7天降解蜡质过程中脱氢酶活性有不同的变化趋势:在降解蚧虫单独蜡壳试验中，各菌株最大脱氢酶活性为V3.4504(0.075±0.003U/mL)＞V3.4505(0.074±0.002U/mL)＞TSL06(0.066±0.002U/mL)＞FDB01(0.061±0.004U/mL);在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验中各菌株最大脱氢酶活性为V3.4505（0.075±0.002U/mL）＞V3.4504(0.070±0.006U/mL)＞FDB01(0.074±0.004U/mL)＞TSL06(0.069±0.002U/mL)。
　　 1.5通过体视显微镜和扫描电镜技术观察蚧虫蜡质受病原真菌降解前后的形态变化发现，在降解蚧虫蜡壳试验组中，降解后蜡壳的结构变得松脆，表面出现许多小孔洞，并有白色附着物，菌丝在蜡质上的附着和穿刺;4菌株对蜡壳的降解率依次为:TSL06(23.10±0.031％)＞V3.4504(18.20±0.019％)＞FDB01(15.4±0.017％)＞V3.4505（11.00±0.011％）。在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验组中，降解后的日本龟蜡蚧蜡壳颜色由原来的乳白色变为暗黄色，结构稀疏膨胀，表面有许多裂孔褶皱，菌丝在蜡质上的附着和穿刺，其中V3.4504和V3.4505菌株主要是以菌丝的形态附着在蜡壳表面，FDB01和TSL06菌株主要是以孢子附着在蜡壳表面，这与前面观察到4菌株在蜡质无机盐培养液中的生存方式是相符的;4菌株对蚧虫“蜡壳+虫体”的降解率依次为:TSL06(32.50±0.03％)＞V3.4504(31.50±0.01％)＞FDB01(30.40±0.03)＞V3.4505(26.90±0.05)。这与前面测定的4菌株最大脂肪酶活性是一致的。
　　 1.6通过作直线回归分析病原真菌酶活性与对蚧虫降解率的关系发现，在降解单独蜡壳试验组中，4菌株对蚧虫蜡质的降解率与病原真菌最大脂肪酶活性之间呈显著的正相关性，相关系数为0.9014;与最大脱氢酶活性之间的相关系数只有0.1789。在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验组中，4菌株对蚧虫蜡质的降解率与病原真菌最大脂肪酶活性之间也呈显著的正相关性，相关系数为0.9332;与最大脱氢酶活性之间呈负正相关性，相关系数0.8525。
　　二、噬蜡细菌—铜绿假单胞菌对蚧虫蜡质的降解作用
　　 2.1测定了噬蜡细菌—铜绿假单胞菌菌株在降解蚧虫蜡质过程中的浓度值(OD)、细胞表面疏水活性(CSH)、脂肪酶活性和对蜡质的降解率，并采用体视显微镜和扫描电镜技术观察了细菌菌株对蚧虫蜡质的降解作用，研究发现，在无机盐固体培养基试验组，蚧虫雌成虫染菌后蜡壳出现融化现象。在降解单独蜡壳试验组中，降解后蜡壳的结构变得松脆，表面出现许多小孔洞，并有白色附着物，菌体在蜡质上附着;对蜡壳的最大降解率为23.50±0.042％。在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验组中降解后的日本龟蜡蚧蜡壳颜色由原来的乳白色变为暗黄色，结构疏松膨胀，表面有许多裂空褶皱，对蚧虫“蜡壳+虫体”的最大降解率为41.82±0.0024％。
　　 2.2测定了噬蜡细菌的不同浓度对蚧虫蜡质的降解率和脂肪酶活性的影响,结果显示:在降解单独蜡壳试验组中，噬蜡细菌的不同浓度的脂肪酶最大活性是OD1(0.172±0.0035U/mL)＞OD3(0.161±0.0093U/mL)＞OD2(0.150±0.0015U/mL)＞OD4(0.087±0.0031U/mL)＞OD5(0.062±0.0070U/mL);对蚧虫蜡质的降解率为OD5(34.29±4.93％)＞OD4(26.45±1.73％)＞OD3(23.43±3.75％)＞OD2(17.56±3.01％)＞OD1（17.20±0.55％）。在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验组中噬蜡菌脂肪酶最大活性为OD1(0.172±0.0035U/mL)＞OD3(0.161±0.0093U/mL)＞OD2(0.150±0.0015U/mL)＞OD4(0.087±0.0031U/mL)＞OD5（0.062±0.0070U/mL）;对“蜡壳+虫体”降解率分别为:OD4（60.35±1.78％）＞OD5（57.60±0.73％）＞OD3（57.24±2.29％）＞OD2(53.47±2.21％)＞OD1(35.47±3.87％)。
　　由此得出，噬蜡细菌的接菌浓度为OD3和OD4最有利于降解蚧虫蜡质。
　　 2.3研究了在PDA培养基上和无机盐液体培养液中噬蜡细菌对蜡蚧霉V3.4504菌株降解蚧虫蜡质的影响，其中噬蜡细菌浓度为OD3和OD4，真菌浓度为2×107spore/mL，两种菌按1∶1的比例接入到无机盐培养液中。结果显示，在PDA固体培养基上噬蜡细菌对蜡蚧霉V3.4504菌株的生长有抑制作用。在无机盐培养液中，噬蜡细菌对V3.4504降解蜡质也有抑制作用:在降解单独蜡壳试验组中，V3.4504的脂肪酶活性为（0.282±0.0055U/mL），而混合菌最大脂肪酶活性则小OD3+V4(0.229±0.0100U/mL)，OD4+V4(0.225±0.0040U/mL);蚧虫蜡壳降解率依次为:V4（18.01±2.93％）＞OD3+V4(16.39±1.26％)＞OD4+V4（14.42±0.41％），说明脂肪酶活性与蜡质降解率是一致的;在降解蚧虫“蜡壳+虫体”试验组中，在7天内V3.4504菌株与混合嗜蜡菌后的脂肪酶最大活性值依次为:V4（0.427±0.0072U/mL）＞OD3+V4(0.259±0.0055U/mL)＞OD4+V4(0.250±0.0026U/mL);“蜡壳+虫体”的降解率分别为OD4+V4(49.30±3.74％)＞OD3+V4（31.17±6.25％）＞V4(30.76±6.11％)，脂肪酶活性与降解率之间不呈正相关关系。

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作者
张志娟;
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作者单位

山西大学;

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授予单位山西大学;
学科动物学
授予学位硕士
导师姓名谢映平;
年度 2013
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正文语种中文
中图分类半翅目害虫;
关键词
蚧虫; 日本龟蜡蚧; 昆虫病原真菌; 噬蜡细菌; 脂肪酶; 脱氢酶;

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