条件性敲除Indian hedgehog基因探讨周期性张应变条件下Indian hedgehog对软骨细胞肥大分化的影响

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研究背景：骨关节炎（osteoarthritis，OA）是常见的关节病之一，以关节软骨的破坏和降解为特点，并且引起关节形态的改变，常导致慢性关节疼痛，甚至造成残疾。研究表明:在OA关节软骨的降解过程中软骨细胞的异常分化类似于软骨内成骨过程中软骨细胞的分化。Indian hedgehog(Ihh)是由前肥大软骨细胞合成和分泌的一种关键的信号分子，在软骨内成骨过程中对软骨细胞的肥大分化和矿化起着重要的调节作用。关节软骨作为一种特殊的组织，不受血管、神经及淋巴液的影响，因此缺乏相应的神经和体液调节，而力学刺激作为一个重要的因素可以显著影响关节软骨的正常生理功能。另外，Ihh对力学刺激敏感，而在机械环境条件下，Ihh对软骨细胞肥大分化的影响并不是很清楚。研究目的以未成熟小鼠肋软骨细胞作为软骨细胞的来源，结合Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl基因工程小鼠，用条件性敲除Ihh基因的方法探讨周期性张应变(CTS;sin10％，0.5HZ，8h/d，3d)条件下Ihh对软骨细胞肥大分化的影响。方法： (1)培育Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl和Ihhfl/fl基因工程小鼠，并鉴定其基因型。 (2)提取未成熟小鼠肋软骨细胞体外培养，并鉴定其表型。 (3)取P1代未成熟小鼠肋软骨细胞，随机分为对照组和CTS组，CTS组加载CTS，通过RT-PCR和ELISA检测Ⅱ型胶原(Collagen typeⅡ，Col-Ⅱ)、蛋白聚糖（aggrecan，AGG）糖胺多糖（glycosaminoglycans，GAG）、Ⅹ型胶原(Collagen typeⅩ，Col-Ⅹ)和基质金属蛋白酶-13（Matrix metalloproteinase13，MMP-13），以观察CTS对软骨细胞肥大分化的影响。 (4)对Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl基因工程小鼠进行Ihh基因敲除，取其P0代肋软骨细胞为敲除组;而Ihhfl/fl基因工程小鼠不能敲除Ihh基因为对照组，通过RT-PCR检测Ihh和Gil-1，观察Ihh基因敲除率。 (5)对注射TM的Ihhfl/fl和Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl小鼠的P1代肋软骨细胞施加CTS，分为CTS组（Ihhfl/fl）和CTS+敲除组（Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl），RT-PCR检测Ihh、Gil-1、Col-Ⅱ、AGG、Col-Ⅹ和MMP-13 mRNA的相对表达量，ELISA检测Col-Ⅱ、GAG、Col-Ⅹ和MMP-13的蛋白表达量，以观察CTS条件性下Ihh对软骨细胞肥大分化的影响。结果： (1)从P0代到P2代，随着传代次数的增加，AGG和COL-Ⅱ mRNA的相对表达量逐渐下降，而COL-Ⅰ mRNA的相对表达量逐渐升高。 (2) RT-PCR和ELISA检测:CTS组Col-Ⅱ和AGG(GAG)的表达低于对照组，Col-Ⅹ和MMP-13的表达高于对照组。 (3)敲除组Ihh和Gil-1 mRNA相对表达量低于对照组，Ihh基因敲除率为64％。 (4)RT-PCR检测:CTS+敲除组Ihh和Gil-1 mRNA相对表达量低于CTS组，Col-Ⅱ和AGG mRNA相对表达量高于对照组，Col-Ⅹ和MMP-13 mRNA的相对表达量低于CTS组;ELISA检测:CTS+敲除组Col-Ⅱ和GAG的蛋白表达量高于对照组，Col-Ⅹ和MMP-13的蛋白表达量低于CTS组。结论： (1)体外单层培养未成熟小鼠肋软骨细胞，反复传代会导致其发生去分化。P1代软骨细胞能够保持其大部分分化表型。 (2) CTS(sin10％，0.5HZ，8h/d，3d)促进软骨细胞肥大分化。 (3)以P1代未成熟小鼠肋软骨细胞作为软骨细胞来源，用条件性敲除Ihh基因的方法研究发现，在CTS(sin10％，0.5HZ，8h/d，3d)条件下Ihh促进软骨细胞肥大分化。

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作者
高耀祖;
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作者单位

山西医科大学;

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授予单位山西医科大学;
学科骨外科学
授予学位硕士
导师姓名卫小春;
年度 2014
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类口腔科学;
关键词
条件性敲除; hedgehog; 基因; 周期性; 变条件; 软骨细胞; 肥大分化;

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