葡萄糖刺激下小鼠胰岛素分泌的时相、囊泡分布及S1P对其的作用研究

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目的：通过分离获得小鼠原代胰岛，观察葡萄糖刺激下小鼠胰岛素分泌的时相及胰岛素分泌囊泡的分布，探究S1P干预对小鼠葡萄糖刺激的胰岛素分泌的影响，为阐明糖尿病的发病机制提供理论依据。方法：(1)采用胶原酶Ⅴ(CollagenaseⅤ)消化小鼠胰腺，体式显微镜下手工挑取胰岛，利用DTZ鉴定胰岛的纯度，过夜培养后显微镜下挑选状态良好的胰岛用于实验。(2)采用免疫荧光法鉴定小鼠胰岛β细胞的分布。(3)小鼠胰岛分别在低糖（2.8mmol/L葡萄糖）和高糖KRB缓冲液（16.7mmol/L葡萄糖）中灌流，放射免疫法分析胰岛素的动态分泌。(4)在低糖及高糖刺激后于电镜下观察胰岛素分泌囊泡在胞浆中分布。(5)采用RT-PCR的方法，检验小鼠胰岛细胞表面S1P受体的表达。(6)观察S1P干预后，小鼠胰岛在低糖和高糖刺激下胰岛素分泌的变化。(7)采用DispaseⅡ消化小鼠胰岛，得到原代小鼠胰岛细胞，利用膜片钳技术观察S1P干预后胰岛细胞上电压依赖性钾电流(Kv)的变化。结果：(1)分离获得的胰岛外观饱满，边缘圆润，可被DTZ染成猩红色，胰岛β细胞位于胰岛中央。(2)葡萄糖刺激的胰岛灌流试验中，胰岛素分泌呈典型峰状分泌，1相分泌曲线下面积平均为4.924±0.536，2相分泌呈平台样均匀分泌，曲线下面积平均为11.18±0.69。(3)电镜结果显示，LG组（含葡萄糖2.8mmol/L）胰岛素囊泡密度为213.3±10.2/(0.1μm∧2)，显著低于HG组249.7±4.2/(0.1μm∧2)(P＜0.01)。距离β细胞膜50nm以内的胰岛素分泌囊泡分别为LG组19.6±0.7/(0.1μm∧2)，HG组18.1±0.94/(0.1μm∧2)，无显著性差异。距离细胞膜50-300nm的胰岛素分泌囊泡，HG组为58.9±2.6/(0.1μm∧2)，显著多于LG组41.4±1.96/(0.1μm∧2)(P＜0.01)。距离细胞膜＞300nm的胰岛素分泌囊泡，HG组为172.7±4.99/(0.1μm∧2)，显著高于LG组152.4±9.52/(0.1μm∧2)，P＜0.05。HG组未成熟的胰岛素分泌囊泡为6.04±0.98/(0.1μm∧2)，高于LG组2.9±0.21/(0.1μm∧2)，P＜0.01。(4)胰岛细胞表面S1P1、S1P2、S1P3的表达分别是0.11±0.03、0.11±0.01、0.05±0.02，P＜0.05。(5)与2.8 mmol/l葡萄糖组相比，16.7mmol/l葡萄糖能够明显的促进胰岛素分泌;S1P干预后，在2.8 mmol/l葡萄糖条件下，胰岛素分泌量增加，16.7mmol/l葡萄糖条件下，S1P能进一步促进胰岛素分泌。(6)膜片钳实验表明，10μmol/lS1P对Kv有明显抑制作用，与对照组相比，在70 mV时，S1P将Kv抑制到了对照组的78％(S1P组，105.7±3.3pA/pF，n=11;对照组，135.4±3.0 pA/pF，n=9，p＜0.001)。结论：(1)使用胶原酶Ⅴ消化获得的小鼠原代胰岛纯度高、活性好。(2)葡萄糖刺激下的小鼠胰岛素1相分泌呈典型峰状，2相分泌呈平台样分泌。(3)高糖刺激5分钟，胰岛素分泌囊泡合成增多，其中锚定囊泡分布无显著增多，但可释放池囊泡及储备池囊泡显著增多。(4)证实小鼠胰岛细胞表面有S1P1、S1P2、S1P3的表达。(5)在低糖和高糖条件下，S1P都能够促进小鼠胰岛胰岛素分泌。(6) S1P能够抑制电压依赖性钾通道。

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作者
张晶晶;
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作者单位

山西医科大学;

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授予单位山西医科大学;
学科内科学
授予学位硕士
导师姓名杨静;
年度 2014
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类内分泌腺疾病及代谢病;
关键词
葡萄糖刺激; 小鼠; 胰岛素分泌; 囊泡; 分布;

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