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缺血后处理启动细胞周期促进受损心肌组织修复的研究

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第一部分 缺血后处理模型的建立

引言

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

第二部分 缺血后处理对心肌组织细胞增殖指标Ki67、H3P的研究

引言

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

第三部分 缺血后处理对心肌组织细胞周期cyclins和CDKs的影响

引言

1、材料与方法

2、 结果

3、讨论

小 结

参考文献

综述

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摘要

目的：缺血后处理(IschemiaPostconditioning,IPO)作为一种内源性保护机制，已经证明可以有效抑制心肌细胞的凋亡，但是否还可以通过诱导细胞增殖，修复受损的心肌组织尚不清楚。本研究通过建立大鼠缺血后处理模型，观察细胞增殖指标Ki67、H3P和细胞周期蛋白cyclins和CDKs的变化，研究IPO能否通过启动细胞周期，诱导心肌细胞的增殖，进而补偿受损心肌组织。
　　方法：
　　1、模型的建立。健康成年雄性8周龄(220±25g)SD大鼠，随机分为3组：假手术组(Shamoperation,Sham)、缺血再灌注组(Ischemia/Reperfusion,I/R)、缺血后处理组(IschemicPostconditioning,IPO)。分别于术后1天、3天、7天和14天检测相关指标。
　　2、血流动力学指标的测定。分别记录术后各时间点血流动力学指标：左室舒张末期压(LVEDP)、左室收缩压(LVSP)、左室等容期上升最大速率(+dp/dtmax)和左室等容期下降最大速率(-dp/dtmax)。
　　3、心肌组织细胞增殖指标Ki67和H3P的检测。分别采用免疫组化SABC法和免疫荧光双标染色法检测术后各时间点Ki67和H3P的表达情况，并随机选取十个视野进行阳性单位和阳性细胞数的统计。
　　4、心肌组织细胞周期cyclins和CDKs的检测。
　　(1)mRNA水平运用RT-PCR法检测术后各时间点细胞周期蛋白(cyclinA、B、D、E)和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK1、2、4、6)的表达，并进行灰度比值分析；
　　(2)蛋白水平运用WesternBlot法检测术后各时间点cyclinA2和cyclinB的表达水平，并进行灰度比值分析；
　　(3)组织水平运用免疫组化SABC法和免疫荧光双标染色法检测术后各时间点cyclinA2和cyclinB的表达，并随机选取十个视野进行阳性单位和阳性细胞数的统计。
　　结果：
　　1、模型的建立。缺血过程中ST段抬高，表明缺血成功；当血液恢复再灌，ST段恢复至正常。
　　2、血流动力学指标的变化。术后各时间点IPO、I/R组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax均明显低于Sham组(P<0.05)，同时LVEDP明显高于Sham组(P<0.05)。与I/R组比较，IPO干预后各时间点LVSP及±dp/dtmax均升高(P<0.05)，而LVEDP有下降趋势。
　　3、心肌细胞增殖指标Ki67和H3P的检测结果。
　　(1)免疫组化SABC法检测Ki67、H3P的表达结果：在心肌组织中散在分布，染色呈棕色的为阳性细胞。Sham组阳性细胞极少，IPO组和I/R组阳性细胞在术后各时间点均有不同程度的增多。统计学分析结果显示：术后各时间点与Sham组比较，IPO组阳性单位显著增多具有统计学差异(P<0.05)，并且观察到正在分裂的心肌细胞。与I/R组比较，IPO组Ki67阳性单位在术后第3天和7天具有统计学差异(P<0.05)，而H3P在术后第3天具有统计学差异(P<0.05)。
　　(2)免疫荧光双标染色法检测Ki67、H3P的表达结果：术后各时间点IPO组阳性细胞数与Sham组比较，在术后第1天、3天和7天有显著统计学差异(P<0.05)；术后第3天、7天IPO组和I/R组比较也具有显著的统计学差异(P<0.05)，可能与免疫荧光双标染色法检测灵敏度高有关。
　　4、心肌组织细胞周期cyclins和CDKs的检测结果。
　　(1)mRNA水平检测cyclinA、B、D、E和CDK1、2、4、6的表达结果：
　　cyclinA2和cyclinB：IPO组和I/R组cyclinA2和cyclinB表达水平在术后各时间点均显著高于Sham组(P<0.05)，且分别在术后3天和7天达到峰值。
　　cyclinD：与Sham组比较，I/R组cyclinD表达水平在术后1天和7天具有统计学差异(P<0.05)，而IPO组cyclinD表达量分别在术后1天，3天和7天具有显著统计学差异(P<0.05)。与I/R组比较，IPO组在术后第3天表达量具有统计学差异(P<0.05)。
　　cyclinE：与Sham组比较，IPO组cyclinE表达水平分别在术后1天，3天和7天具有显著统计学差异(P<0.05)。组间比较，IPO组和I/R组cyclinE表达水平分别在术后3天，7天和14天具有显著统计学差异(P<0.05)。
　　CDK1：与Sham组比较，IPO组和I/R组CDK1表达水平在术后各时间点具有显著统计学差异(P<0.05)。组间比较，术后3天和7天有显著统计学差异(P<0.05)。
　　CDK2：与Sham组比较，I/R组CDK2表达水平在术后3天和7天具有显著统计学差异(P<0.05)，而IPO组CDK2表达水平分别在术后1天，3天和7天具有显著统计学差异(P<0.05)。
　　CDK4和CDK6表达量各组间比较均无统计学差异。
　　(2)蛋白水平检测cyclinA2和cyclinB的表达结果。
　　cyclinA2和cyclinB在Sham组几乎没有表达。IPO和I/R组术后各时间点表达量均有显著增加(P<0.05)。IPO与I/R组比较，cyclinA2表达水平在术后1天，3天和7天均有显著统计学差异(P<0.05)。cyclinB结果与之相同。
　　(3)组织水平检测cyclinA2和cyclinB的表达结果
　　免疫组化SABC法检测cyclinA2和cyclinB的表达结果：Sham组cyclinA2、cyclinB阳性细胞数很少，IPO组和I/R组阳性细胞明显增多。统计学分析表明：cyclinA2IPO组阳性单位在术后第1天、3天和7天显著大于Sham组，且在术后3天与I/R组比较有统计学差异(P<0.05)；cyclinBIPO组阳性单位在术后各时间点显著大于Sham组，且在术后第1天、3天和7天与I/R组比较有统计学差异(P<0.05)。
　　免疫荧光双标染色法检测cyclinA2和cyclinB的表达结果：cyclinA2术后各时间点Sham组cyclinA2阳性细胞数显著少于IPO组和I/R组(P<0.05)。组间比较，术后1天，3天和7天阳性细胞数具有显著统计学差异，且IPO组阳性细胞数在3天达到峰值(P<0.05)；cyclinB术后第1天、3天和7天IPO组阳性细胞数显著大于Sham组(P<0.05)。组间比较，术后3天和7天阳性细胞数具有统计学差异，且IPO组阳性细胞数在3天达到峰值(P<0.05)。
　　结论：
　　1、IPO可有效改善心功能。
　　2、免疫组化SABC法和免疫荧光双标染色法均证明IPO可以诱导细胞增殖特异性指标Ki67和H3P的表达，并且观察到正在分裂的心肌细胞。
　　3、IPO诱导成年期保持沉默的cyclinA2基因的表达，进而其它cyclins及CDKs的表达增加。
　　4、IPO可以启动心肌组织相关cyclins和CDKs的表达，可能通过心肌细胞的增殖补偿或修复受损的心肌组织。

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