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AT1受体自身抗体阳性大鼠的后代在成年期对代谢综合征易感性增加及机制探讨

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前言

第一部分 孕鼠体内AT1-Ab的转运特性及其对后代出生体重的影响

前言

材料和方法

结果

小结

讨论

第二部分 AT1-Ab阳性孕鼠后代成年后对代谢综合征的易感性增加

前言

材料和方法

结果

小结

讨论

第三部分 AT1-Ab对成年大鼠代谢相关指标的影响

前言

材料和方法

结果

小结

讨论

参考文献

附图和表

综述

个人简介

致谢

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摘要

研究背景:
　　 近30年来，心血管疾病已成为威胁人类健康的第一大因素，而集肥胖、糖脂代谢紊乱、高血压为一体的代谢综合征已被证明是导致心血管疾病高患病率和病死率的主要危险因素。因此，阐明代谢综合征的病因和发生机制成为当务之急的医疗重任。一般认为，代谢综合征和现代化不良的生活方式密切相关。但近年来研究发现，机体在生命早期若受到一些不利因素的影响，致使出生时体重过低或过高时，其成年后患代谢综合征、心血管疾病等的几率会明显增加，提示代谢相关疾病可能具有“胎源性”，该理论也被称为“胎儿源性成人疾病”学说。但该学说的病因和病理发生机制目前尚在探索阶段。
　　 胎盘是胎儿汲取营养的场所，普遍认为，胎盘损伤是胎源性成人疾病的重要起始环节。多种已知的危险因素均可导致胎盘结构功能障碍，但仍有很多未知的病理因素亟待探讨。血管紧张素Ⅲ型受体(AT1R)自身抗体(AT1-Ab)是近年来在子痫前期患者血清中发现的一种IgG类免疫球蛋白。我室和他人的离体研究发现，母体内的AT1-Ab通过和AT1R细胞外第二环(AT1R-ECⅡ)序列特异性结合，可诱导胎盘细胞凋亡、减弱滋养层入侵、直接收缩胎盘血管等，提示AT1-Ab可能会降低胎盘灌注量，影响胎盘生长发育。据此我们推测，母体内的AT1-Ab是否会影响胎儿出生体重，如果能，这种出牛体重异常的予代在成年后是否会对代谢相关疾病更易感，如果是，其潜在机制是什么。
　　 为了明确母体内的AT1-Ab对子代生长发育的影响及机制，我们拟解决以下问题：(1)除了对胎盘影响外，母体内IgG类的AT1-Ab能否直接进入后代体内，如果能，通过何种途径？(2)AT1-Ab进入后代体内后是否还具有生物活性，如果有，这种活性对子代出生体重是否有影响？(3)AT1-Ab阳性孕鼠后代成年后是否更易患代谢相关疾病，如果是，这些病变主要源于子代鼠在宫内阶段还是宫外阶段的损伤？以上问题的解决，可能为代谢综合征和相关的心血管疾病的机制阐明以及临床防治提供一定的理论依据。
　　 第一部分:
　　 孕鼠体内AT1-Ab的转运特性及其对后代出生体重的影响
　　 研究目的:
　　 用主动免疫方法建立AT1-Ab阳性的孕鼠模型，观察母鼠体内的AT1-Ab被动转运特性及其对后代出生体重的影响。
　　 材料和方法:
　　 1.实验动物
　　 AT1-Ab阴性的健康未孕的雌性Wistar大鼠，约8周龄，体重180-200g。
　　 2.实验方法
　　 2.1抗原肽段的合成
　　 委托上海吉尔生化公司商业合成人ATIR-ECii肽段(165-191，I-H-R-N-V-F-F-I-E-N-T-N-I-T-V-C-A-F-H-Y-E-S-Q-N-S-T)作为免疫用抗原，纯度为95％。2.2AT1-Ab阳性孕鼠模型的建立
　　 将符合条件的Wistar大鼠随机平分为两组：
　　 ①免疫组(lmmunizedgroup，n=10)：用一卜述抗原肽段主动免疫免疫组雌鼠，8周后将雌鼠与正常雄鼠（未免疫）交配，以发现阴栓为怀孕第0天。在怀孕及哺乳期间，雌鼠每四周加强免疫一次，直至实验结束。每次免疫前鼠尾采血，收集血清-400C储存至测，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中抗体产生情况。
　　 ②溶剂对照组(Vehiclegroup，n=10)：注射液为免疫佐剂与生理盐水（抗原溶液的溶剂）的混合物，实验方案同免疫组。
　　 2.3AT1-Ab转运途径检测
　　 利用上述孕鼠模型：(l)孕20天时，孕鼠行剖宫术，留取胎鼠血清并固定胎盘组织，ELISA法和免疫组化法分别检测其中有无AT1-Ab。(2)在哺乳期，由乳鼠胃内收集母鼠乳汁，ELISA法检测其中AT1-Ab的含量，并对调同日内生产的免疫组和对照组雌性（或雄性）乳鼠，由对方母鼠喂养，同胎生的雄性（或雌性）乳鼠正常哺乳作为参照，7大后，比较各组乳鼠血清中AT1-Ab的含量。
　　 2.4大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)的培养
　　 利用组织贴块法培养原代的胸主动脉平滑肌细胞。
　　 2.5激光共聚焦扫描显微镜(Confocal)测胞内钙
　　 耳又细胞悬液，在避光条件下，加入钙荧光指示剂Fluo-3/AM,370C水浴30mins，PBS液漂沈。将负载了Fluo-3/AM指示剂的细胞悬液加入共聚焦专用JIII中，给予处理后采用激光共聚焦扫描显微镜进行观察。每个视野选取10个细胞进行测定，荧光强度的平均值用F值表示。
　　 2.6大鼠血管环
　　 麻醉大鼠后，快速分离大鼠胸主动脉，置入40C预冷并氧饱和的HEPES液中，剔除周围组织后剪成3-4mm的血管环。血管环用两根不锈钢微型挂钩贯穿血管管腔，水平悬挂在含HEPES液的浴管内。由PowerLab生物信号采集分析系统记录血管张力的变化。血管环平衡1小时后，给予处理。
　　 结果:
　　 lAT1-Ab阳性的孕鼠模型建立成功
　　 为了研究AT1-Ab的被动转运特点，本研究采用主动免疫法建立AT1-Ab阳性的孕鼠模型。ELISA检测显示，待孕的雌性Wistar大鼠于初次免疫后2周，血清中已有AT1-Ab出现，并且滴度迅速升高，在8周时达高峰(OD值为2.76+0.09vs.0.33+0.02，P＜O.OI，vs.同期对照组，图l-1A)，同期对照组则无ATl-Ab产生。而且，免疫鼠生成的AT1-Ab属于IgG类免疫球蛋白（图l-1A）而非IgM类及IgA类（图1-IB，1-IC），同患者的抗体一致，表明主动免疫成功。将此时的免疫组雌鼠与雄鼠合笼，建立起AT1-Ab阳性的孕鼠模型。
　　 亲和柱纯化免疫大鼠抗血清后，得到以AT1-Ab为主要成分的总IgGs，SDS-PAGE纯度检测显示，在55KDa和25KDa附近m现清晰的两条带，分别代表IgG的重链和轻链(图1-2A)。随后，ELISA法对该纯化抗体的IgG亚类鉴定结果证明，免疫鼠中的AT1-Ab主要属于lgG2b，仅小部分属于IgG2a（图1-2B）。
　　 2.母鼠体内的AT1-Ab可穿过大鼠胎盘
　　 ELISA法检测临产时（孕20天）胎鼠皿清，发现AT1-Ab阳性的免疫组孕鼠，其寓内胎鼠血清中AT1-Ab的含量（OD值为2.32+0.10）显著高于对照组胎鼠（OD值为0.13+0.01），两者相比P＜O.OI（图l-3A）。为了更直接地观察AT1-Ab在胎盘中的转运途径，本研究又采用免疫组织化学法对两组胎盘进行染色，结果显示，在免疫鼠胎盘绒毛的滋养层细胞及血管内皮细胞处均有明显黄染（图1-3B），证明有ATl-Ab表达，而溶剂对照组胎盘中却无特异性AT1-Ab存在（图l-3B）。
　　 3.母鼠体内的ATl-Ab还可经乳汁进行转运
　　 哺乳1周时，由免疫组乳鼠胃内得到的母鼠乳汁，其AT1-Ab水平（OD值为1.34+0.11）明显高于溶剂对照组（OD值为0.19+0.03），计算得P[N值大于2.1，即ATl-Ab为阳性(图1-4A)。
　　 为排除乳鼠胃内的乳汁受多种因素干扰（如唾液、胃液），本研究又设计了交叉喂养实验。ELISA检测显示，7天时，rf1免疫组母鼠代喂的对照组雌性乳鼠体内出现了AT1-Ab（OD值为2.60+0.05vs.0.16+0.03，P＜O.01，vs.对照组雄性乳鼠，图l-4B），而rf1对照组母鼠代喂的免疫组雌性现鼠体内ATI-Ab水平比其同胎雄性后代的明显下降（OD值为1.04+0.12vs.2.62+0.08，P＜O.OI，vs.免疫组雄性乳鼠，图l-4B）。4从免疫组后代鼠血清中提纯的总IgGs（ATl-Ab-IgG2a）可升高培养的VSMC胞内钙浓度
　　 用组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,5天后倒置显微镜下可观察到组织块边缘有细胞爬出，10天后可见培养瓶底铺满平行生长的VSMC，呈梭形、长梭形、或带状。待细胞形成致密单层后进行传代，传至第四代时进行实验（图1-5）。Guava流式细胞仪检测显示培养细胞存活率为91％（图1-6）。免疫组化法鉴定结果显示，培养的细胞中SMα-actin呈阳性表达，表明所培养细胞为VSMC（图1-7）。
　　 以Fluo-3/AM为胞内钙指示剂，结果显示，将lymol/l免疫组后代鼠血清中提取的含AT1-Ab的总IgGs(AT1-Ab-IgG2a)加入培养的主动脉平滑肌细胞内，细胞内Ca2十浓度迅速升高，Imin左右荧光值达到高峰。若用Losartan(lOymol/l)预处理细胞20mins，可明显抑制AT1-Ab-IgGs的升Ca2+作用，使得Ca2+摄取延迟。而溶剂对照组后代鼠血清中提取的总IgGs和单纯的Losartan对培养的平滑肌细胞内Ca2+浓度无明显影响（图1-8）。提示免疫组后代鼠体内的AT1-Ab可能会通过激活ATIR促进血管平滑肌细胞内钙升高。5后代鼠血清中的AT1-Ab-IgGs引起大鼠胸主动脉环收缩
　　 免疫组后代鼠血清巾的ATl-Ab-IgG2a（1pLmol/L＞和angiotensinⅡ(l)1mol/L)均可引起大鼠主动脉血管环显著收缩（收缩幅度分别为0.44±0.05g，0.49±0.07g），而溶剂对照组后代鼠血清中的IgG2a则对离体血管环无明显影响（P＜O.OI，P＜O.OI，图1-9）。lOymol/L的Losartan可有效阻断ATl-Ab-IgG2a的缩血管效应（0.05+0.02g，P＜O.OI，vs.ATl-Ab-IgG2a）。6免疫组后代鼠早期发育阶段出现体重异常
　　 AT1-Ab阳性的免疫组的后代鼠(n=47)甲均出牛体重略低于溶剂对照组后代鼠(n_42)体重，尽管两组间没有显著的统计学差异（P=0.06，6.21±0.09gvs.6.46土0.09g，图l-IOA）。但值得注意的是，随着年龄增长，和对照组相比，免疫组后代鼠体重出现较大的离散度，图1-IOB和I-IOC显示的是两个组中同窝所生的3周龄后代鼠的典型图，提示可能有发育的异常。
　　 小结:
　　 1.母鼠体内的AT1-Ab可经胎盘和乳汁转运至后代鼠体内，且后代鼠体内的AT1-Ab仍保留类受体激动剂样的生物效应。2.母鼠体内的AT1-Ab可能会影响后代早年体重。
　　 第一部分:AT1-Ab阳性孕鼠后代成年后对代谢综合征的易感性增加
　　 研究目的:
　　 利用上述的动物模型，观察AT1-Ab阳性孕鼠的后代到成年期后对代谢相关疾病的易感性及发生机制。
　　 材料和方法:
　　 1.动物模型建立
　　 同上
　　 2.糖脂代谢检测
　　 大鼠空腹12小时后静脉采血，葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG)；酶比色法测血清胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)水平；生化分析仪测定血清高密度脂蛋白一胆固醇(HDL-C)含量；放射免疫分析法检测血浆胰岛素(Fins)浓度，并计算稳态模型HOMA-IR指数(FPGxFins/22.5)
　　 3.大鼠血压
　　 大鼠血压采用鼠尾套管法进行检测。
　　 4.肝脂变检测
　　 用4％多聚甲醛固定肝组织，常规石蜡包埋切片，HE染色后，光学显微镜观察。
　　 5.血清脂联素(ADP)检测
　　 分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100lll，余孔分别加标准品或待测样品IOOVI,370C反应120mins;弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液IOOUI，酶标板加上覆膜,370C反应60mins;弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2mins，甩千；每孔加检测溶液B工作液100lll，酶标板加上覆膜,370C反应60mins;温育60mins后，弃去孔内液体，甩下，洗板；依序每孔加底物溶液90Itl，酶标板加上覆膜370C避光显色；依序每孔加终止溶液50pl，终止反应，此对蓝色立转黄色。用酶标仪在450nm波长测量各孑L的光密度（OD值）。
　　 结果:
　　 1.ATl-Ab阳性孕鼠后代40周龄时血清胰岛素水平升高
　　 正常饲养到40周时，两组间后代鼠（n=8/组）的空腹血糖无明显差异（P＞0.05，图2-IA），鼠尾套管法测两组问血压差异也无显著性（P＞0.05，图2-1B）。但和同期对照组相比，免疫组后代鼠体内的胰岛素水平显著升高（23.9+;1.1LilU/mlv.s.12.7+0.5yIU/ml，P＜O.01，图2-1C）。HOMA-IR指数明显高于对照组后代鼠（5.67+0.21vs.2.32+0.15，P＜O.Ol，图2-1D）。
　　 2.AT1-Ab阳性孕鼠后代成年后在高糖刺激下出现代谢综合征症状
　　 为了进一步观察AT1-Ab阳性孕鼠的后代对代谢性疾病的易感性，将后代鼠的正常鼠粮中添加20％蔗糖饲养8周。图2-2显示,48周时，ATl-Ab阳性的免疫组后代鼠体内出现明显的糖脂代谢紊乱，表现为：空腹血糖升高（6.35±0.25mmol/Lvs.溶剂对照组后代鼠5.26±0.17mmol/L，P＜O.01，图2-2A），甘油三酯升高（TG，6.61±0.34mmol/Lvs.2.02±0.1Immol/L，P＜O.01，图2-2B），高密度脂蛋白一胆固醇水平下降(HDL-C，0.48+0.03mmol/Lvs.0.28土0.03mmol/L，P＜0.05，图2-2C)，并且出现脂肪异位沉积，符合代谢综合征诊断标准。但两组后代鼠血压仍无显著性差异（P＞0.05，图2-2D）。
　　 3.胰岛素敏感性下降可能是后代鼠体内代谢综合征发生的重要机制
　　 48周时，HE染色显示，免疫组后代鼠胰岛细胞增生肥大，排列紊乱（图2-3A）。
　　 另外，免疫组后代鼠出现明显的肝脏脂肪沉积及淋巴细胞浸润现象，而对照组后代鼠肝结构基本正常(图2-3B)。
　　 脂联素是一种非常重要的脂肪细胞因子，具有增加胰岛素敏感性、保护心脏的作用，在肥胖和糖尿病等疾患中脂联素的水平显著下降。在本模型中通过检测后代鼠血清中脂联素的变化情况发现，实验结束时，免疫组后代鼠血清中脂联素水平明显低于对照组(3818±612yg/Lvs.5837±678yg/L,P＜0.05，图2-3C).
　　 小结:
　　 1.AT1-Ab阳性孕鼠的后代在成年后对代谢综合征易感性增加。
　　 2.靶器官对胰岛素敏感性下降可能在子代鼠发生代谢综合征的过程中起了重要作用。
　　 第三部分AT1-Ab对成年大鼠代谢相关指标的影响
　　 研究目的
　　 利用主动免疫法，建立AT1-Ab长期阳性的大鼠模型，观察在排除母体因素干扰的情况下，单纯的AT1-Ab能否直接诱导成年大鼠出现糖脂等代谢紊乱。
　　 材料和方法
　　 1.实验动物
　　 20只AT1-Ab阴性的健康Wistar大鼠，雌雄各半，约8周龄，体重180-200g。
　　 2.实验方法
　　 2.1AT1-Ab长期阳性大鼠模型的建立
　　 将符合条件的Wistar大鼠随机平分为免疫组和溶剂对照组，ATIR-ECii肽段主动免疫人鼠40周，建立ATl-AbK期阳性的人鼠模型，方法同上。
　　 2.2糖脂代谢及肝功能检测
　　 采空腹静脉血，全白动生化仪检测肝功（谷丙转氨酶，谷草转氨酶）。糖脂代谢检测方法同上。
　　 2.3内皮素.1(ET-1)测定：
　　 依据试剂盒说明，采用双抗体夹心ELISA法检测血清ET-I含量。
　　 2.4细胞间粘附分子一1（ICAM-I）的检测
　　 采用Confocal技术检测。大鼠胸主动脉切片经清洗后，微波抗原修复，滴加山羊抗大鼠ICAM-I抗体后40C过夜；滴加FITC连接的兔抗山羊lgG二抗,370C温育30mins，PBS清洗5minsx3次。甘油封片后Confocal观察分析。FITC激发波长495nm，发射波长519nm。
　　 2.5血管细胞间粘附分子(VCAM-1)的检测
　　 利用二步法免疫组化试剂，检测大鼠胸主动脉内皮细胞VCAM-1的表达情况。
　　 2.6透射电子显微镜(TEM)检测冠脉内皮和胸主动脉平滑肌细胞的超微结构
　　 人鼠麻醉后将心脏组织和胸主动脉组织（约Imm）快速离体，置于2.5％戊二醛中,40C固定2小时，磷酸盐缓冲液(pH7.4)冲洗，置于1％四氧化锇40C固定2小时,50％到100％乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋,370C过夜,50nm切片，枸橼酸铅溶液染色，以备透射电子显微镜观察。
　　 2.7免疫组化法测血管平滑肌细胞0【肌动蛋白(SMa-actin)、平滑肌肌球蛋白重链.2亚型(SM2-MyHC)和胚胎平滑肌肌球蛋白重链-B(SMemb)的表达
　　 分离大鼠胸主动脉,4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片4¨m。脱蜡水化,3％H202去离子水避光浸洗Smins，高压抗原修复后，分别滴加小鼠抗大鼠SMa-actin-抗，兔抗大鼠SM2-MyHC-抗，或小鼠抗大鼠SMemb-抗,40C过夜，PBS清洗。滴加小鼠或兔IgG-HRP-多克隆二抗,370C孵育30mins，PBST清洗，新鲜配制DAB溶液显色。以腹丰动脉壁.平滑肌细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性表达。每张切片随机摄取6个视野，Image-ProPlu图像分析系统分析图像并计算平均光密度(MOD)。
　　 2.8大鼠肠系膜平滑肌细胞的急性分离
　　 麻醉后取下肠系膜组织，迅速放于预冷的台氏液巾，解剖显微镜下游离二三级肠系膜动脉，剔除表面的脂肪和外膜，剪成2-3mm的小段，放入酶1中，在370C恒温水浴箱中振荡7～lOmins，迅速取出转入酶2中，在370C恒温水浴箱中振荡3-4mins，取ILIJ,酶解过的组织，放入无钙台氏液中，轻轻吹打，在显微镜下观察到有较多折光性好、膜光滑的细胞后终止消化，把细胞悬液滴于小盖玻片上，静置于40C冰箱中保存备用。
　　 2.9单通道电流的记录
　　 利用细胞贴附式和外面向外两种记录模式，观察AT1-Ab对大电导钙激活钾通道(BKCa)的抑制作用。记录的单通道电流通过膜片钳放大器（CE2-2300）放大，l.OkHz低通滤波，经12位A/D、D/A转化器(1322AAxon)，用pCLAMP9.0软件系统，进行数据采样及分析通道活动的开放概率(Po)、平均开放时间(To)、平均关闭时间(Tc)和电流辐度(Am)。
　　 结果:
　　 1.AT1-Ab阳性的主动免疫大鼠模型建立成功
　　 ELISA法检测显示，有9只免疫组人鼠于初次免疫后一个月，血清中已有AT1-Ab出现，之后滴度继续升高。从两个月开始直到免疫结束，抗体维持在较恒定的高水平(免疫40周时OD值1.41±0.36vs.0.33±0.09，P＜O.OI，vs.同期溶剂对照组，图3-1)，而溶剂对照组大鼠体内则无AT1-Ab产生，表明主动免疫成功。没有产生抗体的1只免疫组大鼠弃去。
　　 2.AT1-Ab长期阳性的大鼠体内脂代谢轻度紊乱
　　 丰动免疫40周时，两组大鼠的空腹血糖（图3-2A）及胆固醇（图3-2B）含量均无显著性差异。但与同期对照组相比，免疫鼠体内甘油三酯含量(3.571土1.768mmol/Lvs.1.977:t:0.644mmol/L.P＜0.05，图3-2C)略有升高，而同时高密度脂蛋白水平也代偿性升高(1.118+0.136mmol/Lvs.0.971+-0.】23mmol/L,P＜0.05，图3-2D)。3AT1-Ab长期阳性的大鼠肝功能正常
　　 主动免疫40周时，免疫组大鼠血清谷丙转氨酶（422.7+26.0vs.431.1+19.1，P＞0.05，vs，同期溶剂对照组，图3-3A）和谷草转氨酶(156.9+16.1vs.149.3土34.0，P＞0.05，vs.同期溶剂对照组，图3-3B)未明显升高，提示肝功能正常。
　　 4.AT1-Ab长期阳性的大鼠模型体内血压并未显著升高
　　 在整个免疫过程中，免疫组大鼠与溶剂划‘照组大鼠血压相比，并未出现显著的统计学差异(图3-4)。
　　 5.ATIR-ECii主动免疫36周时大鼠体内血管内皮结构和功能出现损伤
　　 5.1免疫组大鼠血清中ET-l含量升高
　　 ET-1试剂盒检测发现，从免疫12周起到36周，免疫组大鼠血清巾ET-I的含量持续高于溶剂对照组，日.在12周(27.33+3.50pg/ml)和28周(35.33+5.16pg/ml)时出玑两个明显高峰，与溶剂对照组（含量分别为12.00±1.67pg/ml，12.00+2.90pg/ml）相比，均有统计学意义（P＜0.01，P＜0.01）（图3-5）。5.2AT1-Ab长期作用可致胸主动脉内皮依赖性舒张功能下降
　　 血管环检测结果显示，免疫36周时，大鼠胸主动脉的内皮依赖性血管舒张反应有明显下降。采用10-6mol/L去甲肾上腺素预收缩血管，给予10-9～10-6mol/L乙酰胆碱刺激后，累加舒张百分比为50.64±6.25，与溶剂对照组（62.34±4.64）相比，差异有显著性(P＜0.05)(图3-6)。
　　 5.3AT1-Ab长期作用后大鼠胸主动脉内皮结构光镜下无明显损伤
　　 HE染色后，光镜下观察显示，主动免疫36周时，大鼠胸主动脉内皮细胞结构无明显损伤（图3-7）。
　　 5.4AT1-Ab阳性的免疫组大鼠冠脉内皮超微结构改变
　　 透射电镜显示免疫组大鼠冠脉结构，发现毛细血管内皮细胞双层膜之间形成穿泡通道(↑)，吞饮小泡增多(↑)(图3-8A)。且血管内皮细胞膜发泡，小泡脱落，脱落的小泡膜为脂质双分子层，膜内为细胞浆成分(▲)（图3-8B），提示心血管内皮细胞膜通透性增高。图3-8C和3-8D显示内皮细胞线粒体溶解(→)。
　　 5.5免疫组大鼠主动脉内皮细胞中ICAM-1和VCAM-1表达均增强
　　 激光共聚焦技术显示，免疫36周时，免疫组人鼠胸主动脉内皮细胞浆中膜型ICAM-I表达比溶剂对照组显著升高（图3-9）。同ICAM-1结果一致，免疫组化检测显示，免疫36周时免疫组大鼠胸主动脉内皮细胞浆中膜型VCAM-I表达比溶剂对照组也显著升高（P＜0.05，图3-10）。且AT1-Ab阳性的免疫组大鼠胸主动脉周围有明显的淋巴细胞浸润(图3-11)。提示AT1-Ab长期阳性的大鼠血管内皮细胞可能有炎性损伤。6ATIR-EC11主动免疫40周时大鼠体内胸主动脉平滑肌细胞出现表型转变
　　 6.1免疫组大鼠胸主动脉收缩表型蛋白表达下降，合成表型蛋白升高
　　 免疫组织化学方法显示，在免疫40周时，同对照组相比，AT1-Ab长期阳性的大鼠胸主动脉平滑肌细胞收缩蛋白SMα-actin表达下降（P＜0.05，图3-12），SM2-MyHC表达下调（P＜0.01，图3-13），SMemb呈现阳性表达（溶剂对照组SMemb表达阴性，图3-14）。同时，肠系膜动脉平滑肌SM2-MyHC的表达也下调（P＜O.O1，图3-15）。
　　 6.2免疫组大鼠胸主动脉平滑肌依赖性收缩和舒张功能减弱
　　 大鼠胸主动脉去内皮后，以去甲肾卜.腺素为收缩剂，观察到免疫结束时（40周），与溶剂对照组相比，AT1-Ab阳性的免疫组大鼠收缩幅度减弱（图3-16A）。以硝普钠为舒张剂，观察到与溶剂对照组相比，免疫纽大鼠的血管舒张幅度也减弱（图3-16B）。提示AT1-Ab长期存在可能会影响大鼠胸主动脉平滑肌依赖性的收缩和舒张功能。
　　 6.3透射电子显微镜显示免疫组大鼠胸主动脉出现合成型平滑肌细胞的超微结构特征
　　 在免疫40周时，透射电子显微镜显示，AT1-Ab阳性的免疫组大鼠胸主动脉壁血管平滑肌细胞胞浆粗面内质网（←）增多密集、扩张，表明平滑肌细胞合成功能旺盛，分泌的胶原纤维增多（15000×，图3-17A）。平滑肌细胞核近似椭圆形、核凹陷，电子密度深的常染色质（六）占优势、边集，电子密度弱的异染色质(☆)相对弱势，胞浆肌丝溶解(←)（15000×，图3-17B），提示平滑肌细胞的骨架蛋白减少，引起细胞收缩能力下降及细胞形态发生改变。
　　 6.4大鼠肠系膜平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道(BKCa)的特性
　　 室温的情况下，采用细胞贴附式膜片记录，在140mmol/l对称性高钾溶液中，浴液游离Ca2+浓度为10-7mol/l时，大鼠肠系膜平滑肌细胞（图3-18）记录到的典型BKCa单通道电流图如图3-19A所示。随膜电位的增加，通道的电流幅值及开放概率逐渐增加，通道电流与电压拟合后呈现良好的线性关系，其电导值为194±2.9pS(n=10，图3-19B)。通道电流对胞内Ca2+敏感，开放概率随着浴液中游离Ca2+浓度升高而增加。且在外面向外式记录膜片上，给浴液中加入1mmol/lTEA（钾通道阻断剂，见图3-20A）或200nmol/lIBTX(BkCa通道特异性阻断剂，见图3-20B)，可使通道活动完全阻断，证实所记录通道为BKCa。
　　 6.5AT1-Ab-IgGs可通过激活AT1R抑制大鼠肠系膜平滑肌细胞上的BKCa通道
　　 在细胞贴附式膜片下，1OOnmol/l从免疫组大鼠体内提纯的AT1-Ab-IgGs可显著抑制大鼠肠系膜平滑肌细胞上BKCa通道的开放。表现为通道开放概率下降，平均开放时间减少，平均关闭时间增加，而电流幅度值无明显改变（图3-2IA，表1）。同angiotensinⅡ类似（图3-22C，表2），AT1-Ab-IgGs对BKCa通道的效应可以被Losartan明显阻断(图3-22A，表2)，却不能被PD123319阻断（图3-22B，表2）。但从溶剂对照组大鼠体内提纯的IgGs对BKCa通道活性无明显影响（图3-21B，表1）。以上结果提示，AT1-Ab可能通过激活AT1R而抑制VSMC上的BKCa通道的开放。这可能也是AT1-Ab诱导VSMC表型转换的机制之一。
　　 小结:
　　 1.单纯的AT1-Ab长期作用并不能引起成年大鼠出现代谢综合征的典型表现，提示抗体阳性孕鼠的后代在成年期出现代谢紊乱，可能主要是源于AT1-Ab在宫内阶段造成的损伤。
　　 2.AT1-Ab长期刺激可引起大鼠血管内皮损伤和平滑肌表型转换。

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