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缺氧环境下IDH1突变型肿瘤细胞通过IDH2代偿性表达上调参与细胞增殖

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前言

文献回顾

1. IDH的功能概述

2．IDH1/2基因突变特点

3.IDH1/2突变致瘤机制

4．IDH1/2突变与胶质瘤亚型分型关系

4．IDH1/2突变的代谢改变

实验一 人异柠檬酸脱氢酶（IDH1）R132H突变型脑胶质瘤细胞的原代培养以及IDH1稳转细胞株的构建

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 IDH1突变型以及野生型肿瘤细胞在缺氧以及常氧环境下细胞增殖活性检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 在低氧环境下IDH1 R132H突变型以及野生型肿瘤细胞IDH2蛋白水平检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 抑制IDH2蛋白表达水平观察其对肿瘤细胞增殖活性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

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摘要

神经胶质瘤是中枢神经系统最为常见的原发性肿瘤，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)根据临床以及组织病理学标准将其分为Ⅰ-Ⅳ级。多数胶质瘤呈侵袭性生长，其高复发率、高致残率以及高死亡率严重威胁着人类健康，近年来针对胶质瘤的治疗技术虽有很大程度的提高，但疗效并不十分理想。2008年，Parsons等通过高通量表达分析研究，首次发现在胶质母细胞瘤中约有12％发生了异柠檬酸脱氢酶1（isocitrate dehydrogenase1，IDH1）的基因突变，随后，更多学者进一步的研究发现IDH1/2突变作为预后良好的标志普遍存在于Ⅱ级和Ⅲ级胶质瘤以及继发性胶质母细胞瘤。后续越来越多的研究表明IDH1/2突变在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。
　　IDH1和IDH2是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosophate acid，NADP+）依赖型同型二聚体酶，催化异柠檬酸（Isocitrate，ICT）氧化脱羧生成α-酮戊二酸（α-Ketoglutarate，α-KG）、还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和二氧化碳，二者所催化的上述反应为可逆反应。IDH1存在于细胞质和过氧化物酶体中，其代谢产物α-KG对于维持细胞质和细胞核内大量双加氧酶的活性是必需的，其另一代谢产物NADPH既为脂质生物合成提供关键的还原当量，同时也是极其重要的抗氧化剂，用以保护细胞免受氧化损伤。
　　IDH1/2突变导致其催化ICT氧化脱羧生成α-KG能力降低，同时获得还原α-KG生成2-HG这一新的功能，最终引起2-HG在细胞内大量累积，而2-HG作为致癌代谢产物在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。这些致癌机制包括缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）致肿瘤学说、基因组高甲基化学说，以及最近发现2-HG可引起绝缘子功能障碍，通过破坏染色体拓扑结构以及异常调节诱导癌基因表达，最终导致肿瘤发生。
　　脂类作为人体组织的重要组成成分，在供给能量、维持细胞结构和功能中起重要作用。在常氧环境下，脂质合成所需要的原材料主要由葡萄糖供给，葡萄糖进入线粒体在丙酮酸脱氢酶复合体的催化作用下生成乙酰辅酶A（Acetyl–CoA，AcCoA），后者经过柠檬酸-丙酮酸循环进入细胞质，在脂肪酸合酶等的催化作用下生成脂肪酸。然而在低氧环境下，由于丙酮酸脱氢酶复合体活性受到HIF-1α的抑制，导致糖酵解生成的丙酮酸不能够进入线粒体中生成AcCoA。因此，肿瘤组织细胞为了适应低氧环境所造成的不利影响，其必须通过其它途径来代偿合成足够的AcCoA来维持脂质的合成。和葡萄糖一样，谷氨酰胺可以作为能源和供碳以及供氮前体参与到细胞的物质合成代谢。谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下生成谷氨酸，后者进入线粒体，在谷氨酸脱氢酶的作用下进一步转化生成α-KG，生成的α-KG一方面可以延着三羧酸循环方向参与到线粒体能量代谢；另一方面亦可在IDH1/2的催化作用下逆向生成异柠檬酸、柠檬酸，二者出线粒体进入到细胞质中，进一步裂解生成 AcCoA参与到脂质合成。由此，在缺氧条件下肿瘤细胞转而依赖于IDH1/2途径介导的脂质合成以满足细胞增殖需要。
　　由于 IDH1突变不仅抑制了氧化脱羧反应，同时亦抑制了还原羧化反应，导致IDH1突变型肿瘤细胞在低氧环境下表现为脂质合成缺陷细胞，其细胞增殖活性降低。据此我们提出如下科学假说：IDH1和IDH2共同参与了低氧条件细胞的脂质合成，IDH1 R132H突变型肿瘤细胞通过高表达IDH2来补偿因IDH1突变导致的不利影响。
　　本实验中我们采用三组实验细胞作为研究对象。首先，通过组织块培养法，成功培养了IDH1 WT和IDH1+/ R132H突变型星形胶质瘤原代细胞株；第二，采用病毒感染以及药物筛选成功建立了稳定过表达IDH WT和IDH1 R132H U251细胞株；第三为IDH1 WT和IDH1+/R132H HCT116结肠癌细胞株，该细胞株由同源重组技术构建，其突变类型以及表达量均可以很好的模拟病人来源胶质瘤细胞。
　　首先，采用细胞增殖毒性检测实试(cell counting kit-8,CCK-8)比较了常氧和缺氧情况下 IDH1野生型和 R132H突变型细胞的增殖活性，证实在低氧环境下 IDH1 R132H突变型肿瘤细胞增殖活性降低。其次，采用蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）对比检测了上述细胞中IDH2的蛋白水平，首次证实IDH1 R132H突变型肿瘤细胞在缺氧条件下IDH2代偿性升高。最后，我们采用小干扰RNA技术抑制细胞内 IDH2蛋白表达，观察对IDH1 R132H突变型肿瘤细胞增殖活性的影响，结果表明沉默IDH2的表达水平后可以明显抑制IDH1 R132H突变型肿瘤细细胞的增殖活性。
　　本研究首次提出缺氧条件下IDH1 R132H突变型肿瘤细胞通过IDH2的高表达来维持细胞恶性增殖，提示IDH2可以作为一个潜在的抗IDH1 R132H突变型肿瘤的治疗靶点，为临床治疗此类肿瘤提供了新的思路。

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