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SNFYMPL荧光探针结合共聚焦激光显微内镜在胃癌诊断中的应用

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缩略语表

前言

文献回顾

一、胃癌的流行现状

二、胃癌的诊断现状

三、共聚焦激光显微内镜

四、消化道肿瘤研究中的探针和靶向肽SNFYMPL的发现

第一部分 SNF*-FITC短肽荧光探针的合成及与胃癌细胞结合能力检测

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 SNF*-FITC短肽荧光探针与胃癌组织结合能力检测

引言

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 SNF*-FITC的胃癌动物模型活体成像

引言

1 材料

2 方法

3结果

4讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

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摘要

背景:
　　近年来，胃癌在世界范围内的发病率明显降低，但仍然是患病率第五位和死亡率第三的肿瘤，东亚地区更是胃癌的高发地区。早诊断和早治疗是提高胃癌病人生存率的关键手段。普通白光内镜诊断早期胃癌较为困难，对内镜医生的经验要求较高。CLE是近年来兴起的新型内镜检查技术，在诊断胃肠道粘膜微小病变上具有明显优势，CLE与分子探针结合(mCLE)实现特定靶分子的成像，可以在在体情况下检测分子表型的异常。目前，相关研究使用的探针一般为荧光标记的抗体和短肽，相比抗体，荧光标记的短肽探针，具有诸多优点。线性七肽SNFYMPL是通过噬菌体展示技术和全细胞差减法，用Barrett食管组织筛选出的新型靶向肽。研究表明，该靶向肽可通过连接片段标记荧光分子成为荧光探针，短肽荧光探针可以特异性结合食管腺癌细胞系OE33。荧光探针孵育离体组织，表明探针与高级别上皮内瘤变食管粘膜选择性结合，亲和性明显高于鳞状上皮和肠化生组织，具备在黏膜局部发现食管腺癌及其癌前病变的能力。
　　由于胃癌和食管腺癌有着相似的组织来源和疾病演变过程，SNFYMPL制作的荧光探针用于胃癌诊断成为可能。前期工作中，我们对该短肽与胃癌细胞的结合能力做了初步检测，该短肽同样可以与胃癌细胞系结合，但其在体内外胃癌细胞上结合的特异性以及潜在的人体应用价值尚不明确。
　　目的:
　　1、合成荧光探针SNF*-FITC，并验证其与胃癌细胞系的结合能力；
　　2、验证荧光探针SNF*-FITC与胃癌组织的结合能力。
　　方法:
　　1、合成荧光探针SNF*-FITC，并验证与胃癌细胞系的结合能力。
　　(1)在试剂公司协助下，从头合成荧光探针，使用HPLC和 ESI-MS等技术纯化鉴定成品质量；
　　(2)使用荧光探针SNF*-FITC对两种胃癌细胞系进行荧光染色，使用共聚焦显微镜观察荧光强度。无关序列肽探针GGG*-FITC作为对照探针，正常胃黏膜上皮细胞系GES作为阴性对照细胞系；
　　(3)使用荧光探针SNF*-FITC和胃癌细胞悬液进行孵育，使用荧光激活细胞分选术检测结合比例和荧光强度。GGG*-FITC作为对照探针，GES作为对照细胞系；
　　(4)使用生物素标记的短肽SNFYMPL-biotin对胃癌细胞系进行免疫化学染色，并进行竞争结合实验比较其与未标记肽的结合能力。
　　2、验证荧光探针SNF*-FITC与胃癌组织的集合和能力。
　　(1)胃癌手术切除组织和邻近非肿瘤组织的快速冰冻切片，使用两种探针进行荧光染色，使用共聚焦显微镜观察荧光强度，统计阳性率；
　　(2)胃癌手术切除组织块和邻近非肿瘤组织使用探针进行荧光染色，使用探头式活体共聚焦激光显微内镜观察分辨能力，统计阳性率；
　　(3)每例患者样本均做HE染色，结果作为金标准。
　　3、验证在内镜检查中使用荧光探针SNF*-FITC发现胃癌组织的能力：建立胃癌的裸鼠皮下荷瘤模型，使用IVIS观察荧光探针在动物活体上与肿瘤组织的结合能力。
　　结果:
　　(1)合成了短肽荧光探针SNF*-FITC，纯度达到95.99％。
　　(2)肿瘤细胞系的荧光染色，可见SNF*-FITC探针优先结合在肿瘤细胞的细胞膜和细胞质，与正常胃粘膜上皮细胞几乎不结合；荧光强度明显强于对照肽探针GGG*-FITC。
　　(3)荧光激活细胞分选，两种胃癌细胞系与SNF*-FITC的平均结合荧光强度均在102左右，结合比例高于95％，对照探针以及正常胃粘膜上皮细胞荧光强度和结合比例均低于100和1%。
　　(4)细胞的免疫化学染色，SNFYMPL-biotin与肿瘤细胞结合呈强阳性，与GES结合呈弱阳性。用过量未标记的短肽SNFYMPL与之竞争结合，细胞仍可与标记生物素的肽结合、呈色，表明连接成为探针的短肽和未标记短肽都有相似的靶向肿瘤细胞能力。
　　(5)冰冻切片的荧光染色，SNF*-FITC对胃癌组织荧光染色的阳性率为81.25%(39/48)，明显优于无关序列肽探针的14.58%(7/48)，差异有统计学意义(P＜0.001)。SNF*-FITC对癌旁组织荧光染色的阳性率为27.08%(13/48)，明显低于对胃癌组织荧光染色阳性率，差异有统计学意义(P＜0.001)。
　　(6)组织块的SNF*-FITC荧光探针染色，使用探头式活体共聚焦激光显微内镜检测，胃癌组织的染色阳性率为83.33%(5/6)。
　　结论:
　　SNFYMPL制备的荧光探针SNF*-FITC与胃癌细胞系有较强结合能力和特异性，明显优于无关序列肽探针GGG*-FITC。其结合靶标位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞质。SNF*-FITC探针与胃癌组织有较强结合能力和特异性，表明SNF*-FITC可以在胃黏膜局部应用，对癌组织进行分子成像，具备潜力成为共聚焦激光显微内镜在胃癌诊断中使用的新型靶向分子探针。

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