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MFGE8在肝炎-肝硬化-肝癌疾病进展中的表达及作用研究

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在肝炎-肝纤维化/肝硬化-肝癌的疾病进展过程中，病毒感染、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝炎和肝毒性物质等各种损伤因素引起肝细胞坏死或凋亡，通过自分泌和旁分泌等方式释放细胞因子，激活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）和Kupffer细胞，导致炎症反应的慢性化。肝纤维化是炎症刺激和损伤修复的早期阶段，具有一定的可逆性，当去除致病因素时，活化的肝星状细胞发生凋亡，胶原沉积减少，肝组织结构和功能恢复。如果损伤和慢性炎症持续，最终可进展为肝硬化和肝癌。
　　细胞因子是一类由免疫原等刺激原诱导产生可溶性的分泌蛋白，可以来源于多种细胞，通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有调节细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、细胞凋亡、免疫反应等多种功能，并形成复杂的细胞因子调节网络，参与机体很多重要的生理功能。乳脂球表皮生长因子8（milk fat globule-epidermal growth factor-factor8，MFGE8）是一种亲脂性糖蛋白，广泛参与细胞间的相互作用，在炎症损伤、纤维化、肿瘤发生发展等多种疾病中发挥重要作用。
　　本课题的研究目标是筛选肝炎-肝纤维化-肝癌疾病进展中关键的细胞因子，并研究其功能，分为以下三个部分：
　　第一部分、肝炎-肝纤维化-肝癌疾病进展相关细胞因子的筛选
　　用四氯化碳（ carbon tetrachloride， CCl4）和N-亚硝基二乙胺/苯巴比妥（N-diethylnitrosamine/phenobarbital，DEN/PB）分别诱导C3H雄性小鼠，收集CCl4诱导2周、6周、8周，DEN诱导2月、5月、8月以及健康小鼠的血清（每组5只），用定制的细胞因子芯片进行筛选，分析肝纤维化和肝癌疾病进展过程中升高趋势最明显的4个因子，用小鼠肝组织进行real-time PCR初步验证。结果显示，TGF-β在肝纤维化中轻度升高，在CCl4诱导2周后升高1.7倍（P＜0.01）；chordin的变化没有统计学差异；prostasin在肝癌过程中显著升高，在DEN诱导2月、5月、8月后分别升高2.7倍、5.4倍和2.5倍（P＜0.01）；MFGE8在肝纤维化中显著升高，在CCl4诱导2周、6周、8周后分别升高3.8倍、3.3倍和3.4倍（p＜0.001），在肝癌过程中有逐渐升高趋势，在DEN诱导2月、5月、8月后分别升高1.1倍、1.6倍和2.3倍，提示MFGE8可能在肝炎-肝纤维化-肝癌进展过程中发挥重要作用，有必要对其功能予以深入研究。
　　第二部分、MFGE8在急性肝损伤小鼠模型和肝纤维化小鼠模型中的表达
　　为了进一步验证MFGE8的表达，我们构建了CCl4诱导的急性肝损伤小鼠模型和肝纤维化小鼠模型，进行免疫组织化学染色分析。研究发现，在急性肝损伤小鼠模型和肝纤维化小鼠模型中，MFGE8的表达均升高，主要在肝细胞的细胞浆中表达。ELISA结果表明，在急性肝损伤小鼠模型中，血清MFGE8表达显著升高（p＜0.001），在第1天达到峰值，然后逐渐降低，第6天降低至正常水平；而在肝纤维化小鼠模型中，MFGE8表达随着诱导时间逐渐增多（p＜0.001）。Real-time PCR检测发现，在急性肝损伤小鼠模型中，MFGE8 mRNA水平在CCl4诱导3天后升高4.4倍（p＜0.001），在肝纤维化小鼠模型中，MFGE8 mRNA水平在CCl4诱导2周和6周分别升高4.2倍和5.0倍（p＜0.001）。Western blot结果也证实MFGE8的表达是升高的。为了进一步证明MFGE8是肝细胞释放的，我们分离并培养小鼠原代肝细胞，结果发现，随着体外培养时间的延长，上清中MFGE8表达逐渐升高，与对照组相比，CCl4刺激使MFGE8表达进一步增加，real-time PCR和western blot结果进一步证实CCl4刺激上调MFGE8的表达（P＜0.05）。CCl4刺激原代肝细胞后，Bcl-2表达下降，Bax表达升高，而外源性补充MFGE8治疗后，Bcl-2表达升高，Bax表达下降，提示MFGE8有抗凋亡作用。LX-2细胞给予不同浓度的人重组MFGE8蛋白刺激后，活化程度呈浓度依赖的下降，提示MFGE8在肝纤维化进展中抑制LX-2细胞的活化。在肝癌细胞Huh-7中干涉MFGE8蛋白表达后，Bcl-2表达下降，Bax表达升高，提示MFGE8在肝癌细胞Huh-7中有抗凋亡的作用。
　　第三部分、MFGE8在肝炎-肝纤维化-肝癌中的临床意义
　　利用正常人组织芯片对 MFGE8在人体主要组织的表达分布情况进行免疫组织化学染色分析，结果发现MFGE8广泛表达在上皮来源的细胞中。为了进一步探索MFGE8在肝炎-肝纤维化-肝癌中的临床意义，我们收集肝炎、肝硬化、肝癌患者和正常人的血清与肝组织样本，进行ELISA和免疫组织化学染色，观察MFGE8在临床样本中的表达。免疫组织化学染色发现，MFGE8主要表达在肝细胞的细胞膜和细胞浆中，MFGE8在肝细胞肝癌中的表达降低（P＜0.01）。ELISA结果发现，在肝炎患者血清中MFGE8表达升高（P＜0.01），在肝硬化和肝癌患者血清中MFGE8表达下降，提示MFGE8可能是肝炎-肝纤维化-肝癌进展中的分子标志物，其潜在的诊断和治疗价值有待进一步研究。

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