• 主题
高级搜索  >
历史搜索 清空历史
首页> 中文学位 >靶向载多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD对人肝癌细胞MHCC-H的体外、体内增殖抑制作用及凋亡机制研究
【6h】

靶向载多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD对人肝癌细胞MHCC-H的体外、体内增殖抑制作用及凋亡机制研究

代理获取
页面导航
  • 目录
  • 摘要
  • 著录项
  • 相似文献
  • 相关主题

目录

封面

声明

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献综述

1. 我国肝癌的现状及主要治疗手段

2. 微泡联合超声参与肿瘤的治疗

3. 小结

第一部分 靶向载多西紫杉醇脂质微泡的制备

1 实验目的

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

附录

第二部分 UTMD介导靶向载多西紫杉醇脂质微泡对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制作用及靶向能力测定

1 实验目的

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

附录

第三部分 靶向载多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD对人肝癌细胞MHCC-H增殖抑制、凋亡作用机制研究

1 实验目的

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

小结

附录

参考文献

研究成果

致谢

展开▼

摘要

（一）靶向载多西紫杉醇脂质微泡的制备及性质测定
　　目的：制备靶向载多西紫杉醇微泡，连接肿瘤血管内皮细胞特异性的CD105单克隆抗体。
　　方法：本研究采用改良薄膜水化、机械振荡法制备载多西杉醇脂质超声微泡（DocetaxelLoaded Lipid Microbubble，DLLM）。通过生物素-链亲和素连接载药脂质体微泡（DLLM）以及CD105单克隆抗体，得到靶向载多西紫杉醇微泡（CD105-DLLM）。随后进行了以下性质测定：
　　1.靶向载多西紫杉醇微泡特征和性质测定：冻干机冻干后，扫描电镜（SEM）下观察；采用粒度分析仪测量微泡粒径，将微泡按一定比例稀释，水浴超声分散30min，测量微泡粒径；
　　2.CD105-DLLM包封率和载药量测定：使用反相高效液相色谱（HPLC）法检测包封率、载药量；
　　3.CD105-DLLM的体外释药测定：通过制备模拟体液，将CD105-DLLM装入透析袋，分为UTMD（UltrasoundTargeted Microbubble Destruction，超声靶向微泡破坏技术）组、自然释放组，进行体外释药测定，浓度由HPLC法测得；
　　4.CD105-DLLM稳定性初步考察：将新鲜制备的CD105-DLLM冻干后，分别保存在冷藏（2-8℃）或常温环境下，之后每日取少量微泡，并观察微泡并照片，同时检测包封率和载药量。
　　结果：
　　1.一般形态观察：扫描电镜（SEM）下，CD105-DLLM形态规则，外形圆整，分散好，未见明显粘连，粒径分布均匀。平均粒径：3220±1570 nm。
　　2.HPLC法测定CD105-DLLM包封率及载药量：测得包封率为80-86.5％，载药量18.5-23%。
　　3.稳定性实验结果：4℃下存放微泡为适宜温度，微泡宜新鲜制备。
　　4.HPLC法测得在48h内，CD105-DLLM+UTMD组在超声爆破后得以完全释放，药物释放率达到100%，达到快速释放的目的。
　　结论：本部分实验制备了一种靶向微泡-将多西紫杉醇包封于脂质体中并连接CD105抗体，制备了稳定性较好，包封率、载药量均较高的CD105-DLLM，还能在UTMD介导下能够达到快速释放的目的。
　　（二）UTMD介导下靶向载多西紫杉醇脂质体微泡（CD105-DLLM）对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制作用及靶向能力测定
　　目的：通过体外细胞及荷瘤动物体内实验，探讨由CD105单克隆抗体标记的载多西紫杉醇脂质体微泡（CD105-DLLM+UTMD）对人肝癌细胞MHCC-H的靶向能力；通过离体（细胞）及在体（动物）实验，明确 CD105-DLLM+UTMD对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制效果。
　　方法：体外培育MHCC-H肝癌细胞系。细胞培养条件：37℃、5%CO2、饱和湿度，含10%胎牛血清的DMEM-HG培养，隔日换液，90%融合时传代。待细胞生长状态稳定时进行实验，分为四组：Control，DOC，DLLM，CD105-DLLM+UTMD。对不同组别细胞分别进行以下测定：
　　1.CD105-DLLM体外寻靶实验：分别使用Cy3-PEG-Biotin标记CD105-DLLM、DLLM，选取处于对数生长期的MHCC-H细胞，置于6孔板中爬片生长后染色后，激光共聚焦显微镜（LSCM）下观察微泡对肝癌细胞的体外靶向能力，用IPP7.0分析软件进行数据分析统计。
　　2.体外细胞活力、增殖抑制实验。用CCK-8法检测四组不同方式对人肝癌细胞MHCC-H增殖抑制作用，具体包括：
　　①通过CCK-8法测定不同处理方式对人肝癌细胞MHCC-H细胞活力的影响；
　　②通过CCK-8法测定不同处理方式对人肝癌细胞MHCC-H增殖的作用。
　　3.荷瘤裸鼠体内CD105-DLLM寻靶实验：采用快速种植法建立荷瘤裸鼠模型。
　　①建模成功后，分别向裸鼠尾静脉注入Cy-3标记CD105-DLLM后给予UTMD和Cy3标记的DLLM；将麻醉好的荷瘤裸鼠置于小动物活体成像系统实验台内，检测Cy-3染料标记CD105-DLLM在荷瘤裸鼠体内发光情况；
　　②观察不同处理方式对荷瘤裸鼠生存时间的影响，绘制生存曲线图；
　　③检测、观察不同组别中荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响，并用超声二维成像、小动物活体成像系统对裸鼠体内CD105-DLLM联合UTMD后的情况进行图像采集、分析。
　　结果：
　　1.体外细胞活力结果显示：CD105-DLLM+UTMD组在4h后其细胞活力的抑制作用显著强于其它各组（P<0.01）；
　　2.细胞增殖抑制实验结果表明：CD105-DLLM+UTMD组在各时间点内对人肝癌细胞MHCC-H的增殖抑制作用均明显高于其它各组（P<0.01）。
　　3.通过免疫荧光实验观察到CD105–DLLM在体外具备良好的靶向性。
　　4.荷瘤裸鼠体内实验：
　　①HE染色结果示成功建立MHCC-H荷瘤裸鼠模型；
　　②体内动物寻靶能力测定结果：小动物活体荧光成像发现，CD105-DLLM组可检测到红色荧光聚集于肿瘤部位，而Control组无法检测到区别于背景的红色荧光区域，证实了CD105-DLLM在荷瘤裸鼠体内也具有良好的靶向性；
　　③对各组的荷瘤裸鼠进行了生存曲线对比。结果显示，CD105-DLLM+UTMD组裸鼠较 Control组相比，生存时间明显延长。
　　④超声二维图示CD105-DLLM+UTMD组裸鼠肿瘤体积相对Control组，肿瘤体积明显减小。
　　结论：
　　1.CD105-DLLM+UTMD能够降低人肝癌细胞 MHCC-H细胞活力；
　　2.CD105-DLLM+UTMD对MHCC-H细胞具有增殖抑制作用；
　　3.CD105-DLLM在体外（细胞）、体内（荷瘤裸鼠）均具备靶向能力。
　　（三）UTMD介导下CD105-DLLM对人肝癌细胞 MHCC-H增殖抑制、凋亡的作用机制
　　目的：探讨UTMD下的CD105-DLLM对于人肝癌细胞MHCC-H的作用，研究其细胞周期、细胞凋亡、凋亡相关蛋白的影响，探索凋亡相关机制。
　　方法：将对数生长期 MHCC-H细胞分为四组：空白微泡（CON），单纯多西紫杉醇（DOC），载多西紫杉醇微泡（DLLM），靶向载多西紫杉醇脂质微泡并以超声爆破（ CD105-DLLM+UTMD）组：
　　1.用流式细胞仪检测细胞周期、凋亡周期；
　　2.用TUNEL检测各组MHCC-H细胞的凋亡，用IPP7.0软件选取凋亡细胞，计算凋亡细胞百分比；
　　3.Western blotting检测各组凋亡相关蛋白Bax，Bcl-2，Cyto-c，P53， Caspase-3表达的变化、蛋白含量；
　　4.激光共聚焦显微镜（LSCM）下观察人肝癌MHCC-H活细胞中Caspase-3含量及细胞形态变化。
　　结果
　　：1.流式细胞仪检测结果显示：CD105-DLLM+UTMD显著抑制分裂期细胞比例。CD105-DLLM联合超声靶向释药显著抑制肝癌细胞MHCC-H分裂期细胞比例，能在抑制肝癌细胞增殖的同时显著增加MHCC-H细胞凋亡率；
　　2.TUNEL原位凋亡检测显示CD105-DLLM诱导人肝癌细胞 MHCC-H凋亡；
　　3.CD105-DLLM+UTMD组中，Cyt-c、Bax/Bcl-2、P53的表达均显著高于其他各组（P均<0.01），而在Caspase3的激活实验中，发现DOC组及CD105-DLLM+UTMD组均可引起Caspase3的大量激活，以CD105-DLLM+UTMD引起的Caspase-3数量更为显著。
　　4.通过 LSCM观察活细胞Caspase-3的含量，在5h内细胞核中可见Caspase3激活产生的绿色团块（凋亡细胞）出现并逐渐增多，而细胞质及细胞形态无变化；5h后细胞核内绿色团块继续增加、细胞质内逐步出现绿色凋亡小体；在作用10h后，CD105-DLLM+UTMD组出现了明显的Caspase-3移位，多数激活的Caspase-3转移至细胞膜表面。
　　结论：在该试验条件下，UTMD介导的CD105-DLLM可通过抑制增值期细胞比例来抑制肝癌细胞增殖，同时激活了凋亡同路并诱导人肝癌细胞MHCC-H发生凋亡、引起了Caspase-3激活及移位，从而发挥其肿瘤抑制作用。
　　小结：本实验将多西紫杉醇包封于脂质体中并连接CD105抗体，制备了稳定性较好，包封率、载药量均较高，在UTMD介导下能够快速释放的靶向载药脂质超声微泡。通过对各组人肝癌细胞 MHCC-H的细胞活力、细胞增殖水平的测定发现：CD105-DLLM+UTMD能够明显降低MHCC-H细胞活力、对MHCC-H细胞具有增殖抑制作用；通过寻靶实验，验证了CD105-DLLM在体外（细胞）、体内（荷瘤裸鼠）均具备靶向能力；活细胞检测结果显示：由 UTMD介导的CD105-DLLM引起了Caspase3激活及移位、可诱导MHCC-H肝细胞发生凋亡，Western blotting检测所示Cyto-c和Caspase-3在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。

著录项

相似文献

  • 中文文献
  • 外文文献
  • 专利
代理获取

客服邮箱：kefu@zhangqiaokeyan.com

京公网安备：11010802029741号 ICP备案号：京ICP备15016152号-6 六维联合信息科技 (北京) 有限公司©版权所有

  • 客服微信

  • 服务号