重组人骨形态发生蛋白-2明胶纳米微球的制备及其对SD大鼠骨髓基质干细胞生物学行为的影响

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背景:
　　骨缺损和骨不愈合是临床常见病，如何修复骨缺损和促进骨愈合也是骨组织工程研究的重要内容。支架、细胞和因子是骨组织工程研究的三大要素。近年来，有关骨生长因子的研究日益增多，BMP-2（Bone Morphogenetic Protein-2，骨形态发生蛋白-2）是最重要的骨生长因子之一，其促进骨修复的功能已得到相关研究证实。BMP-2在体内含量很少，基因重组表达技术则实现了rhBMP-2（Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2，重组人骨形态发生蛋白-2）的批量生产，使其临床应用成为可能，但rhBMP-2的应用存在体内半衰期短、降解快的问题，如果增加其使用量将又会带来一系列的并发症，使其临床应用严重受限。微球缓释技术是解决这个问题的方法之一，rhBMP-2与微球复合，不但能保护因子，还能延长其在体内的作用时间，减少并发症和治疗费用。所以，本研究的目的是为rhBMP-2制备一种纳米载体，使其更广泛地应用于骨科疾病的治疗。
　　目的:
　　1.制备重组人骨形态发生蛋白-2-明胶纳米微球（Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein-2-Gelatin nanoparticle，rhBMP-2-GN)，检测其理化特性和释药特点。
　　2.检测rhBMP-2-GN对BMSCs（Bone marrow mesenchymal stem cells）的增值和分化效应。
　　3.为rhBMP-2的临床应用提供合适的纳米载体，为下一步动物实验提供必要的依据和更加可靠的解决方案。
　　方法：
　　1. rhBMP-2-GN的制备及检测：（1）制备空白明胶纳米微球。（2）扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）观察明胶纳米微球的表面形态，计算其平均粒径，透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）观察明胶纳米微球的内部结构，粒度分析仪检测其吸水后的平均粒径，计算其溶胀率。（3）将rhBMP-2和GN进行复合制备rhBMP-2-GN，利用酶联免疫吸附法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）测定加载的rhBMP-2量，计算其包封率和载药量。（4）将rhBMP-2-GN分散到磷酸盐缓冲液（PBS）中，检测其累计释药的百分率。
　　2. rhBMP-2-GN对BMSCs的生物效应：(1)利用CCK-8法检测rhBMP-2-GN对BMSCs早期增殖效应的影响。(2)利用ALP染色法检测rhBMP-2-GN对BMSCs早期分化效应的影响。(3)利用茜素红-S钙结节染色法检测rhBMP-2-GN对BMSCs晚期分化效应的影响。
　　结果：
　　1.rhBMP-2-GN的制备：（1）“二次凝聚法”成功制备空白明胶纳米微球。（2）明胶纳米微球的物理特性：明胶纳米微球表面光滑，球形规整，内部多孔隙、通道，分散均一，干粉状态平均粒径为171.49 nm，吸水膨胀后平均粒径为313.01 nm，溶胀率为1.83。（3）成功制备rhBMP-2-GN，其包封率和载药量分别是98.13±0.131％和58.89±0.079 ng/mg。（4）rhBMP-2-GN的体外释药时间在一个月以上。
　　2. rhBMP-2-GN对BMSCs的生物学作用：（1）rhBMP-2-GN组在第4天和第7天的细胞增值作用均明显优于对照组和明胶纳米微球组（P<0.05）。（2）rhBMP-2-GN孔在第4天和第7天的ALP染色均比对照孔和明胶纳米微球孔的染色要深，差异较明显。（3）rhBMP-2-GN孔在第28天出现钙结节的数目能明显多于对照孔和明胶纳米微球孔。
　　结论：
　　1.“二次凝聚法”成功制备空白明胶纳米微球，使rhBMP-2-GN具有较高的包封率和载药量，体外缓释效果良好。2. rhBMP-2-GN通过明胶纳米微球的降解逐步释放rhBMP-2，延长了rhBMP-2的作用时间，明显促进了BMSCs的早期增殖和向成骨细胞分化。

著录项

作者
孟祥飞;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科临床医学
授予学位硕士
导师姓名郭征;
年度 2015
页码
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类生物材料学;
关键词
明胶; 纳米微球; 重组人骨形态发生蛋白-2; 生物效应; 骨髓基质干细胞; 生物学行为; 动物模型;

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