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伤害性初级传入的突触前及突触后NMDA受体介导慢性痛敏化的分子机制研究

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文献回顾

1 中枢敏化及其机制

2 NMDA受体与疼痛

3 趋化因子及趋化因子受体

正文

第一部分： 痛感受器NMDA自身受体的致痛敏作用及其机制

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分：CCL2对脊髓背角突触后神经元NMDA的

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢

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摘要

近年来,慢性痛的机制研究取得了长足的进展,大量的受体、通道、激酶系统在慢性痛的发生、发展中的作用逐渐被揭示。炎症或损伤后感觉神经元第一级突触的谷氨酸能突触的功能性变化在慢性痛的发展和维持中起关键作用。在慢性疼痛中枢敏化的过程中,NMDA受体同样发挥着重要的作用。免疫组织化学研究显示NMDA受体广泛表达于中枢神经系统突触后神经元上,同时大量的研究表明,NMDA受体也同时表达在突触前终末以及背根节(dorsal root ganglion,DRG)神经元上。DRG位于外周神经系统,位于其内的中、小型神经元,包括其胞体及中枢突和外周突的A和C纤维,主要负责感受和传递痛觉信息,因此又被称为痛感受器或伤害性感受器(nociceptor)。由于这些受体可被痛感受器自身释放的谷氨酸所激活,所以又被称为痛感受器的自身受体或自受体(autoreceptor)。脊髓背角突触前终末释放谷氨酸可被多种因素影响,其中激活I类促代谢型谷氨酸受体、P2X3受体会导致突触前末梢释放谷氨酸增加,而激活μ-阿片受体、α2肾上腺素能受体、CB1大麻素受体、GABAB受体以及II类和III类促代谢型谷氨酸受体都可以导致突触前谷氨酸释放的降低。谷氨酸能突触的功能主要能被三个因素影响:
　　①突触前谷氨酸能神经元释放的谷氨酸量;
　　②进入突触间隙中谷氨酸转运体摄取谷氨酸的比率;
　　③突触后膜上功能性谷氨酸受体的数量。
　　在其他神经系统的研究表明,突触前NMDA受体可以调节海马、小脑等部位的突触递质释放。Bardoniet等在正常动物的脊髓薄片标本上的研究表明,激活外周传入末梢的突触前NMDA受体,可以抑制脊髓背角eEPSC的幅值,延长eEPSC的潜伏期;进一步表明突触前NMDA受体的激活可以抑制脊髓背角Lamina II神经元的突触传递,这一结果提示突触前的NMDA自身受体可能对痛觉信息的传入产生负反馈调节作用。因此,突触前末梢释放的谷氨酸可直接作用于突触前的NMDA受体,产生复杂多样的作用。传统观念认为其最主要功能是作为负反馈抑制突触前递质的释放,从而防止突触间隙的递质浓度过高。
　　前期研究表明,激活吗啡耐受大鼠的突触前NMDA受体可以增强突触前末梢谷氨酸的释放。在癫痫动物模型上,激活前脑突触前NMDA受体也可以导致突触前末梢谷氨酸的释放增加。免疫组织化学和免疫印迹实验结果发现在损伤或炎症诱发的慢性痛状态下,痛感受器NMDA自身受体的表达水平明显升高。功能学研究结果显示慢性痛状态下痛感受器NMDA自身受体的功能活动呈现明显增强,例如,实验性结肠炎诱发痛感受器NMDA自身受体的磷酸化水平显著升高、NMDA诱发的内向电流幅度和细胞内钙浓度明显上升。这些研究结果均提示慢性痛状态下,痛感受器NMDA自身受体的功能状态显著增强。鞘内注射NMDA激活突触前NMDA受体可以导致外周终末释放P物质。Yan等发现,在外周损伤的情况下,突触前NMDA受体活动的增强则可以提高突触前谷氨酸的释放。在病理状态下,已有的行为学研究显示,局部注入NMDA受体拮抗剂对炎症或损伤诱致的痛过敏和神经元放电增强具有显著的抑制作用而非增强作用。这些结果提示在炎症或损伤的情况下,突触前NMDA受体可能发生了活动依赖性改变,即在脊髓浅层由生理状态转为炎症病理状态时,突触前NMDA受体对突触传递的抑制效应转变成兴奋效应。尽管上述结果提示外周部位的NMDA受体可能在病理状态下具有致痛敏作用,但这些结果均来自于外周局部注入NMDA受体拮抗剂,而这些拮抗剂的特异性、作用时程以及确切的作用靶点都难以确定,因此上述结果还不能确切揭示痛感受器NMDA自身受体在病理状态下的具体作用及功能。综上所述,为了特异性地揭示痛感受器NMDA自身受体是否在慢性病理性痛中发挥着致痛敏作用,我们应用Cre-loxP技术在痛感受器上建立了条件性敲除NMDA自身受体的必需组分——功能亚单位NR1基因的转基因动物模型,即特异性地剔除痛感受器NMDA自身受体的正常结构和功能,而保留中枢神经系统以及非神经系统的NMDA受体结构和功能完整。
　　本研究在痛感受器上建立了条件性敲除NMDA自身受体的转基因动物模型,进一步研究突触前NMDA受体在生理状态以及病理状态下对伤害性感受神经元第一级突触的作用,从而研究病理过程中的突触前NMDA受体的活动依赖性改变,为进一步认识NMDA受体的作用和功能奠定基础。
　　有研究表明脊髓背角浅层的突触后神经元上的离子通道变化在慢性痛的中枢敏化过程中发挥重要作用。突触后神经元内Ca2+浓度的动态变化可以编码突触前后神经元的动作电位时序,进而启动引起突触传递效率改变的胞内过程。一般认为,重复在EPSP之后刺激突触后神经元产生动作电位可以高度激活突触后NMDA受体,产生大幅度的Ca2+内流,激活钙离子/钙调蛋白依赖的蛋白激酶 II(CaMKII)而导致LTP的产生。因此,突触后NMDA受体的功能性改变对中枢敏化的产生及发展起关键性作用。
　　CCL2又称为单核细胞趋化因子-1(monocytes chemoattractant protein1,MCP-1),其可以招募单核细胞到达炎症、感染、外伤、局部缺血等部位。大量实验表明CCL2与疼痛密切相关。电生理实验发现在培养DRG神经元上充灌CCL2可以导致细胞内钙离子浓度增加。同时表现出神经病理性痛行为的动物DRG神经元在给予CCL2后可发生显著的去极化。CCL2导致的痛感受器敏化可能是由于其激活了 TRP通道以及抑制了K+电导。Yang等的研究表明,CCL2抑制了一种电压依赖的不失活的外向流,推测可能是外向整流钾电流。CCL2通过轴浆运输从DRG输送到外周神经终末,从而在皮内注射CCL2也可以直接导致机械痛敏反应的增强。同时大量的研究表明,外周神经损伤后,CCL2可能作为一种神经调制,从外周神经到脊髓背角具有活动依赖性释放的特征,即不同的病理条件可以通过调节CCL2的释放,进而影响病理性过程。
　　也有研究表明,CCR2也表达在脊髓背角神经元胞体。但是神经元胞体上的CCR2结合了CCL2后如何发挥功能尚未见报道。我们的研究进一步发现,CCL2可以结合脊髓背角神经元上的CCR2,通过进一步激活细胞外信号相关蛋白激酶(extracellular signal regulated kinases,ERK)信号通路,从而导致脊髓背角突触后神经元NMDA受体通道功能的上调,进而对慢性痛发挥进行调节,而这种作用主要是通过NR2B亚单位介导的。炎症条件下,花生四烯酸可以通过Cox酶解产生前列腺素(prostglandin,PG),其中前列腺素E2(PGE2)参与炎症反应,并可以刺激外周神经末梢引起痛觉敏化,而Cox-2的表达在炎症刺激下显著升高。而抑制Cox-2即可以抑制PGE2。研究表明,在海马PGE2可以作用于突触前EP2受体从而导致突触前谷氨酸释放的增加。大量研究表明,PGE2可以诱导CCL2/MCP-1的释放。本研究结果表明,CCL2诱导的脊髓背角突触后神经元NMDA电流增强的作用不能被Cox-2阻断剂完全阻断,因此CCL2可直接作用于神经元胞体,通过ERK调节NR2B从而导致中枢敏化。
　　第一部分、痛感受器NMDA自身受体的致痛敏作用及其机制
　　在慢性疼痛的中枢敏化过程中,NMDA受体发挥着重要的作用。大量结果提示外周部位的NMDA受体可能在病理状态下具有致痛敏作用,但是应用拮抗剂进行研究具有一定的局限性。目前的研究结果还不能确切揭示痛感受器NMDA自身受体在病理状态下的具体作用及功能,因此我们拟用在痛感受器上条件性敲除NMDA自身受体的转基因动物模型,进一步研究突触前NMDA受体在生理状态以及病理状态下对伤害性感受神经元第一级突触的作用,旨在研究病理过程中的突触前NMDA受体的活动依赖性改变,为进一步认识NMDA受体的作用和功能奠定基础。
　　结果如下:
　　1.建立SNS-NR1-/-小鼠
　　我们应用Cre-loxP技术在痛感受器上建立了条件性敲除NR1亚单位的转基因动物模型。电生理实验中,灌流给予NMDA可在 NR1fl/fl小鼠中IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元上诱致一显著的内向电流,并且对NMDA受体拮抗剂AP5敏感;而NMDA诱发的内向电流在SNS-NR1-/-小鼠中几乎被完全阻断,说明在DRG神经元上,伤害感受性神经元的NMDA受体功能被完全敲除,而其他非伤害性感受神经元上的NMDA受体功能未受影响。
　　2.行为学表型
　　通过行为学研究发现,NR1fl/fl小鼠与 SNS-NR1-/-小鼠的正常机械性痛域和热痛域没有显著性差异。在后肢足底皮下注射Capsaicin诱致的急性自发痛反应过程中,NR1fl/fl小鼠与SNS-NR1-/-小鼠在反应时间上也没有显著差异。Formalin诱致的第二相持续性自发痛反应程度在SNS-NR1-/-小鼠中显著低于野生型小鼠,而后肢足底注射CFA诱致的机械性痛域和热痛域则明显弱于野生型小鼠。
　　3.机制探讨
　　在DRG上应用全细胞膜片钳记录神经元,用串刺激使神经元释放谷氨酸,在串放电之后可以见到明显的内向电流,并且这个内向电流可以被NMDA受体阻断剂AP5所阻断。说明DRG释放的谷氨酸可以作用于周围神经元或者自身NMDA受体并发挥功能。
　　NR1fl/fl小鼠与SNS-NR1-/-小鼠的IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元静息膜电位、基强度以及阈值都没有显著差异。在CFA足底注射24 h后,NR1fl/fl动物神经元的静息膜电位、基强度以及阈值显著降低,而SNS-NR1-/-动物的IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元的静息膜电位、阈值显著降低,但是基强度无变化。而在对照组中,NR1fl/fl小鼠及SNS-NR1-/-小鼠中DRG神经元的静息膜电位、基强度以及阈值无显著变化。
　　研究发现,在NR1fl/fl小鼠,IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元在采用不同斜率的斜波注入电流引起的神经元放电的个数在 CFA注射24 h后显著升高,而在SNS-NR1-/-小鼠IB4-Fluor488阳性标记的伤害性DRG神经元,CFA足底注射24 h后并无显著变化。
　　通过电生理实验给予背根2Hz低频条件刺激,在 NR1fl/fl小鼠向PAG投射的脊髓背角I层神经元上可诱导长时程增强现象(LTP)。而在特异性敲除突触前NMDA受体的SNS-NR1-/-小鼠上,向PAG投射的脊髓背角I层神经元上的LTP被显著抑制。
　　第二部分、CCL2对脊髓背角Lamina II突触后神经元NMDA受体的直接作用
　　本文拟对脊髓背角Lamina II神经元NMDA受体进行检测,观察单核细胞趋化因子-1(MCP-1)对脊髓背角Lamina II神经元NMDA受体的作用，进一步阐释炎性致痛敏过程中，激活小胶质细胞以及星形胶质细胞释放的细胞因子、趋化因子不仅仅可以通过作用于小胶质细胞本身增强突触后神经元的反应性，也可以通过趋化因子直接作用于突触后神经元胞体，从而通过直接调控突触后胞体上NMDA受体的表达来调控神经元的反应特性，突触后NMDA受体的活动依赖性改变可以进一步引起中枢敏化，造成炎性损伤。
　　结果如下:
　　1.CCL2诱致动物痛行为反应增强对11只8wC57BL/6动物进行行为学检测发现CCL2可以诱导痛行为增强。给予C57BL/6小鼠单次鞘内注射100闪的CCL2可以诱发炎症痛敏反应，导致缩足反射的潜伏期缩短。应用CCL2的天然受体CCR2的拮抗剂RS504393，可以抑制CCL2诱发的炎性痛敏反应。
　　CFA注射1d后，C57BL/6表现出持续的机械痛敏及热痛敏行为学表型。而腹腔注射RS504393后，CFA导致的机械痛敏及热痛敏被显著地抑制。CFA注射1d后，C57BL/6表现出的持续机械痛敏及热痛敏可以被NR2B的抑制剂Ifenprodil所阻断。
　　2.炎症损伤后CCL2和CCR2表达上调实时定量PCR(Real-time PCR)显示脊髓的CCR2 mRNA的表达在CFA导致的炎性痛中明显上调。通过Western blot研究发现CCL2可以显著增强NR2B的蛋白水平，而腹腔注射RS504393可以减弱这种表达增强。
　　3.CCL2致痛敏作用的细胞分子机制通过在神经元上进行全细胞膜片钳实验以及单细胞PCR发现，5例Lamina II神经元上中的4例神经元可以诱导出NMDA电流，并且其中的两例CCL2可增强NMDA诱发电流，提示NMDA受体与CCR2可共表达;单细胞PCR实验发现可以诱发NMDA电流的神经元同时也表达囊泡谷氨酸转运体2;表达囊泡抑制性氨基酸转运体的抑制性神经元并不能诱发NMDA电流，提示NMDA受体可能不表达在抑制性神经元上。
　　Westen blot实验发现，CCL2可以直接增强神经元PERK的水平，同时这种增强作用可以被细胞内加入PERK的阻断剂PD98059所阻断，同时也可被细胞外加入CCR2抑制剂RS504393所阻断。
　　电生理学实验结果进一步显示，表面灌流CCL2(100 ng/ml)可以导致NMDA电流的显著增加，而这种增加可以被CCR2的拮抗剂RS504393所阻断。同时发现CCL2可以增强CFA致炎性痛敏动物Lamina II神经元的NMDA电流。突触的电生理学实验表明，表面灌流CCL2/MCP-1 2 min并不能增强AMPAR介导的诱发兴奋性突触后电流(evoked excitatory postsynaptic current,eEPSC)，但是显著增强了NMDAR介导的eEPSC。表明CCL2可以直接或者间接作用于突触后NMDA受体从而引发突触后作用。
　　在CFA注射24 h后炎性痛敏动物脊髓背角Lamina II神经元表面灌流CCR2拮抗剂RS504393可以在短时间内(<2 min)显著降低NMDA诱发电流。应用NR2B的特异性阻断剂Ifenprodil，可以部分阻断脊髓背角Lamina II神经元上的NMDA电流，同时也可以阻断CCL2对NMDA电流的增强作用。
　　应用在体电生理实验技术，在麻醉动物脊髓背角记录场电位EPSP(fEPSP)给予强直条件刺激后，可以在脊髓背角诱发fEPSP的增强，这种增强可以持续数小时。研究发现，在体脊髓诱发的LTP可以被RS504393翻转。
　　结论:1.在生理状态下，脊髓背角第一级突触的突触前NMDA受体，对伤害性信号的突触传递主要发挥抑制性调控作用。
　　2.在慢性炎症病理状态下，脊髓背角第一级突触的突触前NMDA受体发生活动依赖性改变，对伤害性信号的突触传递发挥增强效应，加剧中枢痛敏的形成。
　　3.CCL2/MCP-1直接作用于脊髓背角突触后神经元胞体CCR2受体。
　　4.CCR2NMDA的激活可以导致ERK磷酸化增加，并进一步通过NR2B导致突触后受体活动性增强。

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