心肌营养素-1诱导小鼠诱导性多能干细胞心肌细胞定向分化的实验研究

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背景：
　　2006年Takahashi等采用逆转录病毒系统向小鼠的成纤维细胞导入4个转录因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc),成功将其重新编程为诱导性多能干细胞(iPSCs),这一发现引起了人们的极大兴趣和关注并获得2012年诺贝尔医学生理学奖。由于iPSCs具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的自我更新和多向分化的特性,同时又避免了ES细胞的免疫排斥、伦理学争议等焦点问题,因此很快成为了干细胞领域的研究热点。随后,大量研究证实iPSC可分化成为包括心肌细胞在内的所有三胚层来源的细胞类型,这使得用iPSC进行心肌损伤性疾病的细胞治疗成为可能。然而,诱导iPSCs向心肌细胞定向分化的高效方法,仍然是困扰心肌再生研究的一大瓶颈问题。心肌营养素-1(CT-1)作为在小鼠胚胎心脏发生过程中高表达的转录因子,已被证实对胚胎干细胞(ESCs)和骨髓间充质干细胞(BMMSCs)等多种类型的干细胞的心肌细胞定向分化具有促进作用。然而,目前尚未见有关CT-1对iPSC诱导作用的报道。
　　目的：
　　本实验采用CT-1对小鼠诱导性多能干细胞(miPSCs)进行诱导,观察其对心肌细胞定向分化的作用。
　　方法：
　　(1)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的原代分离、培养以及饲养层细胞的制备;
　　(2)iPSC的培养(复苏、传代、冻存);
　　(3)免疫荧光染色鉴定小鼠iPSC多能性标志物Oct-4;
　　(4)悬滴三步法诱导制备拟胚体(EBs),使用含或不含CT-1的诱导分化培养基进行干预;
　　(5)RealtimePCR检测不同诱导时间点拟胚体中心肌特异性标志物的基因表达水平;
　　(6)采用免疫荧光染色及流式细胞术检测对照组与CT-1组间心肌特异性分化标志物肌钙蛋白I(cTnI)的表达变化差异;
　　(7)采用透射电镜观察对照组与CT-1组间心肌样细胞(iPS-CM)的超微结构变化。
　　结果：
　　(1)miPSC在倒置显微镜下观察呈圆形或椭圆形克隆,边界透亮、清晰、立体感强。多能性干细胞标志物Oct-4免疫荧光染色后呈阳性;
　　(2)实时荧光定量PCR结果显示,CT-1组中心脏中胚层标志物flk-1基因第7、第10天的表达水平,分别为同期对照组的(1.61±0.03)倍和(2.01±0.01)倍(P<0.05);心脏祖细胞标志物Nkx2.5基因第7、第10、第14天的表达水平,分别为同期对照组的(2.08±0.08)倍、(2.12±0.15)倍和(1.99±0.06)倍(P<0.01);心脏发育早期转录因子Tbx5基因第7、第10天的表达水平,分别为同期对照组的(1.61±0.05)倍和(1.86±0.04)倍(P<0.05)。心肌特异性标志物cTnT基因第10、第14天的表达水平,分别为同期对照组的(1.75±0.04)倍和(1.78±0.05)倍(P<0.05),说明CT-1可显著提高EB中心脏发生过程中各阶段特异性标志物基因表达的水平。
　　(3)免疫荧光染色法检测结果显示,两组均有cTnI表达。流式细胞术鉴定结果显示,对照组与CT-1组cTnI的阳性率分别为(28.5±4.2)％和(56.4±6.6)%,有显著性差异(P<0.05)。
　　(4)透射电镜结果显示,CT-1组肌原纤维及胞内线粒体明显增多,肌纤维排列规则,可见细胞间桥粒连接和缝隙连接。
　　结论：
　　本实验研究结果表明,CT-1可通过上调心脏中胚层标志物Flk-1和心脏祖细胞标志物Nkx2.5、Tbx5的表达,显著提高miPSC向心肌细胞定向分化的效率并促进iPS-CM的成熟。为使用iPSC对心肌梗死、充血性心力衰竭等心肌损伤性疾病进行细胞治疗提供了重要的实验方法和体外实验依据。

著录项

作者
刘通;
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作者单位

第四军医大学;

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授予单位第四军医大学;
学科临床医学;内科学(心血管病)
授予学位硕士
导师姓名曹丰;
年度 2013
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原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类心肌疾病;
关键词
心肌营养素-1; 动物模型; 多能干细胞; 心肌细胞; 定向分化;

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