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雌激素缺乏导致的骨质疏松环境中TNF-α通过MiR-21影响小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

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文献回顾

一、绝经后骨质疏松

二、BMSCs与成骨分化

三、MicroRNA

正文

第一部分 来源于OVX和Sham小鼠的mBMSCs成骨能力的比较

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 雌激素缺乏导致的骨质疏松环境中影响mBMSCs成骨能力关键miRNA的筛选及其功能研究

实验一 雌激素缺乏导致骨质疏松环境中影响mBMSCs成骨关键miRNA的筛选

1 材料

2 方法

3 结果

实验二miR-21对OVX-mBMSCs成骨分化的调控作用

1材料

2方法

3 结果

讨论

第三部分 雌激素缺乏导致的骨质疏松环境中影响mBMSCs成骨分化的分子调控机制：TNF-α抑制miR-21

实验一 雌激素缺乏导致的骨质疏松环境中影响miR-21成骨作用主要炎症因子的筛选

1材料

2 方法

实验二 TNF-α通过miR-21抑制mBMSCs成骨作用

1材料

2 方法

3 结果

讨论

第四部分 TNF-α通过miR-21抑制mBMSCs成骨分化机制的体内实验验证

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢

临 床 病 例 报 告

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摘要

绝经后骨质疏松（Postmenopausal osteoporosis，PMOP）是绝经后妇女的高发病症，系代谢性骨病变，表现为单位体积内骨组织量减少，其特点为骨形成与骨吸收平衡紊乱。在绝经后骨质疏松发病过程的早期，破骨活动加强，成骨也随之代偿性加强，但随着病程的进展，由于雌激素（estrogen，E2）缺乏引起一些炎症因子，例如白介素1(IL-1）、白介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ（IFN-γ）水平升高，使成骨活动受到抑制，从而导致成骨破骨的平衡被打破，引起骨量丧失。目前对PMOP发病过程中炎症因子，尤其是TNF-α促进破骨的研究很多，其机制也逐渐被阐明，而关于TNF-α抑制成骨的机制并不明确。
　　骨形成主要为成骨细胞的成熟矿化，而骨髓间充质干细胞（Bone marrow stromal cells，mBMSCs）是成骨细胞的前体细胞。BMSCs向成骨细胞分化的能力，将直接影响到机体的骨形成。近年来一些研究表明PMOP发病过程中mBMSCs的成骨功能受损，但是参与其中的分子机制目前尚不清楚。
　　MicroRNA（miRNA）是一种非编码小分子RNA，长度为19～25个核苷酸序列，具有高度的组织特异性和序列保守性。近年大量研究已经表明，一些miRNA在干细胞的增殖、分化、凋亡等生物学进程以及一些肿瘤及炎症相关疾病中发挥了关键的调控作用。其作用机制是它们识别于特定的靶mRNA，并与后者3’非翻译区相结合，于转录后负向调控后者表达。PMOP的环境是一种炎症微环境，那么在这种的微环境中，miRNA的调控作用是否会受到影响？以及会受到怎样的影响？受到影响的miRNA调控作用是否会导致到干细胞的成骨分化受到影响？其分子机制又是如何？为了回答这些问题，本研究通过建立绝经后骨质疏松C57小鼠模型，对其与假手术组（Sham）的mBMSCs进行miRNA芯片扫描，并结合生物信息学技术，筛选出关键microRNA（miR-21）。研究miR-21在雌激素缺乏所导致的骨质疏松微环境中对骨髓间充质干细胞成骨分化的调控作用，将有助于进一步加深对PMOP的致病机理的了解，为PMOP的治疗提供新的思路和方法。
　　研究目的
　　（1）寻找雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境下调控mBMSCs成骨的关键miRNA（miR-21）。
　　（2）探讨在miR-21在雌激素缺乏所导致的骨质疏松微环境下是否参与调控mBMSCs成骨及其在此种微环境下对成骨的调控作用。
　　（3）探讨在雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境中炎症因子对miR-21的调控，以及对mBMSCs成骨影响的分子机制。
　　研究方法
　　（1）建立去势（OVX）动物模型，通过microCT、组织学方法以及real time RT-PCR、western blot、茜素红和ALP染色等技术观察OVX小鼠BMSCs（mBMSCs）的成骨能力，Elisa方法检测OVX小鼠体内E2，各种炎症因子的水平。
　　（2）通过生物信息学技术以及microRNA基因芯片技术对OVX组和Sham组的C57BL/6J小鼠来源的mBMSCs进行对比筛选，确定调控mBMSCs成骨的关键miRNA（miR-21）。利用real time RT-PCR技术验证miR-21在OVX及Sham组mBMSCs成骨分化过程中的表达差异。通过细胞转染技术上调和下调miR-21，real time RT-PCR、western blot、茜素红和ALP染色等技术观察转染后mBMSCs的成骨能力。
　　（3）在成骨诱导的过程中，分别用IFN-γ（0.1ng/mL）、IL-1β(1ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)刺激正常C57小鼠来源的mBMSCs，real time RT-PCR技术检测miR-21的表达。对照芯片结果，筛选出主要影响miR-21的炎症因子（TNF-α）。在TNF-α刺激下，过表达miR-21，real time RT-PCR和western blot技术分别检测成骨相关基因的表达情况。
　　（4）通过分别注射E2和TNF-α中和抗体至OVX后C57小鼠体内，检测其体内TNF-α水平及miR-21的表达，体内验证miR-21雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境中的成骨分子机制。
　　结果：
　　1、成功建立小鼠 OVX模型，OVX组骨密度明显低于 Sham组，OVX组mBMSCs的成骨能力低于Sham组，OVX小鼠体内E2水平降低，各种炎症因子的水平升高。
　　2、通过生物信息学技术以及microRNA基因芯片技术筛选，确定调控mBMSCs成骨的关键miRNA：miR-21。real time RT-PCR显示miR-21在OVX组mBMSCs成骨分化中的水平较Sham组低。转染miR-21至OVX组mBMSCs，能部分恢复其成骨分化能力。
　　3、筛选出主要影响miR-21的炎症因子：TNF-α。在TNF-α刺激下，mBMSCs成骨能力降低，miR-21表达水平降低。转染miR-21至TNF-α刺激下的mBMSCs，real time RT-PCR、western blot、茜素红和ALP染色等技术提示miR-21能部分恢复其成骨分化能力。
　　4、注射E2和TNF-α中和抗体至OVX小鼠体内，结果显示OVX组小鼠体内TNF-α水平回落，miR-21水平回升，股骨骨密度增高。
　　结论：
　　1、miR-21是雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境中调控mBMSCs成骨分化的关键miRNA。
　　2、miR-21在雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境中能促进 mBMSCs的成骨分化。
　　3、在雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境中，TNF-α是主要影响miR-21的炎症因子，它能下调miR-21的表达水平。上调miR-21能恢复TNF-α抑制的成骨能力。
　　4、在雌激素缺乏所导致的骨质疏松环境中，TNF-α通过抑制miR-21从而导致mBMSCs成骨能力受损，可能是PMOP形成机理之一。

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