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乙型肝炎病毒X蛋白通过上调Capn4表达促进肝癌细胞迁移的研究

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乙型肝炎病毒X 蛋白通过上调Cap114 表达促进肝癌细胞迁移的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

结论

参考文献

个人简历和研究成果

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摘要

背景:
　　乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染与肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生发展之间具有十分密切的关系,其中乙型肝炎病毒X蛋白(Hepatitis B virus X protein,HBx)发挥着极其重要的作用。既往实验研究发现,HBx在诱导肝细胞癌发生发展中具有参与反式激活与信号转导、调节细胞凋亡与增殖、促进癌细胞侵袭与转移等多种生物学功能。但HBx促进肝癌细胞侵袭与转移的分子机制依然尚未完全清楚。近期研究发现,钙蛋白酶小亚基(Calpain small subunit1,Capn4)在肝细胞癌肝移植术后复发组织及转移灶中为高表达,提示Capn4在肝癌细胞侵袭与转移的过程中发挥着重要作用。因此,有必要进一步研究HBx与Capn4之间的关系和相互作用机制。
　　目的:
　　本实验以人肝癌细胞系HepG2和H7402为研究对象,通过瞬时和稳定转染HBV X基因,检测HBx在肝癌细胞中对Capn4表达的影响,观察Capn4在HBx促进肝癌细胞迁移过程中的作用,探讨HBx调节Capn4的分子机制,从而阐明HBx促进肝癌细胞侵袭及转移的新的分子机制,并为临床治疗HBV感染性肝细胞癌的转移提供理论依据。
　　方法:
　　1、通过在HepG2和H7402细胞系中稳定转染HBV X基因,建立稳定表达HBx的细胞系模型HepG2-X和H7402-X,并应用报告基因、Real-time PCR和Western blot三种实验手段,分别检测Capn4在HepG2(H7402)与HepG2-X(H7402-X)细胞系中的表达差异;同时,应用小RNA干扰(siRNA)技术沉默HBx在HepG2-X(H7402-X)中的表达,观察Capn4表达量的变化。
　　2、在HepG2和H7402细胞系中瞬时转染HBV X基因,并通过报告基因、Real-time PCR和Western blot三种实验手段检测转染24小时后细胞内Capn4表达量的变化。
　　3、以人肝癌细胞系HepG2为模型,通过单层细胞伤痕修复实验检测Capn4在HBx促进的肝癌细胞迁移过程中的作用。
　　4、应用生物信息学软件分析Capn4的启动子序列,发现其中存在核因子κB(Nuclear Factor-κB,NF-κB)的潜在结合位点。应用siRNA和特异性化学抑制剂,在HepG2-X和H7402-X细胞中对NF-κB进行沉默和抑制,再应用报告基因和Western blot两种实验手段检测细胞中Capn4表达量的变化。以单碱基点突变技术将Capn4启动子序列中的潜在的NF-κB结合位点进行突变,并应用报告基因检测HBx对突变型Capn4启动子的激活情况。
　　结果:
　　1、在HepG2-X(H7402-X)细胞系中,Capn4的表达在转录水平和翻译水平均明显高于其在HepG2(H7402)细胞系中的表达。同时,针对HBx的siRNA可抑制Capn4的表达。
　　2、瞬时转染HBV X基因24小时后,HepG2和H7402细胞中的Capn4表达量在转录水平和翻译水平均有明显上升。
　　3、稳定表达HBx的人肝癌细胞HepG2-X的迁移能力明显高于未表达HBx的HepG2细胞,而针对HBV X基因的siRNA可显著降低HepG2-X的迁移能力。在HepG2-X细胞中应用siRNA沉默Capn4的表达后, HepG2-X的迁移能力也显著降低。
　　4、在HepG2-X和H7402-X细胞中,通过对NF-κB进行沉默和抑制,Capn4的表达量明显降低。在HepG2和H7402细胞中,HBx不能激活NF-κB结合位点突变的Capn4启动子。
　　结论:
　　在人肝癌细胞系HepG2与H7402中,HBx可以上调Capn4的表达;Capn4的高表达参与了HBx促进的肝癌细胞的迁移;HBx通过激活NF-κB并促进p65入核而上调Capn4表达。提示HBx通过上调Capn4的表达,促进了肝癌细胞的迁移和转移。

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