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中国HIV-1B亚型Gag、Nef、Pol和Env区保守性CTL表位的鉴定

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获得性免疫缺陷综合征（AIDS）绝大多数是由人类免疫缺陷病毒I 型（HIV-1）引起的全球流行的传染病，并成为人类主要的致死性疾病之一。据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织公布的《2006 年世界艾滋病报告》估计，自1981 年首次发现HIV-1 感染者以来，2006 年全球感染人数已达3950 万人，新增430 万名患者。全球每天有1.1 万人感染HIV，同时每天有8000 名感染者死亡。高效抗逆转录病毒疗法（HAART）虽能降低部分患者病毒含量，重建部分免疫功能，延缓病情发展，改善症状，但因药物副作用而使许多患者难以耐受，依从差，更为重要的是HAART 不能完全清除病毒。所以寻找有效HIV-1 疫苗是目前迫切需要解决的问题。大量研究证明细胞免疫特别是HIV-1 特异性CTL 应答反应在控制HIV-1 感染中起关键作用，故研发以诱导HIV-1 特异性CTL 应答为目的的疫苗意义重大。开发此类疫苗首先要确定能诱导强的HIV-1 特异性CTL 应答并具有广泛免疫原性的特异性表位。有效的HIV-1 特异性CTL 应答不仅由抗原结构决定，同时受HLA-I 等位基因限制，因此在筛选和鉴定具有强的和广泛作用的HIV-1 特异性CTL 表位时，研究表位的HLA-错误！未找到引用源。类分子的限制性是不可缺少的工作。不同人群HLA-错误！未找到引用源。等位基因分布频率不同，决定了不同人群HIV-1 的CTL 应答模式不同，所以在不同人群筛选可用于研制疫苗的表位非常必要。中国作为世界人口最多的国家，存在许多潜在的HIV-1 蔓延危险因素，2006 年底统计估计已有65 万人感染HIV-1，开发有效疫苗是控制HIV-1感染的最佳途径。中国人群常见HLA-错误！未找到引用源。等位基因分布频率不同于白种人群，HIV-1 病毒主要流行株与国外也存在差异，这就决定了中国人群对HIV-1 的CTL 应答模式不同于白种人及黑人。故筛选出中国人群常见等位基因限制的HIV-1 特异性CTL 表位将对研发针对中国人群诱导特异性CTL 应答的HIV-1 疫苗具有重要的现实意义。 HIV-1B 亚型是中国的主要流行亚型，同时HIV-1B 亚型诱导的特异性CTL 应答具有交叉性，因此，本研究选择HIV-1B 亚型感染者为研究对象，用ELISpot 法检测覆盖HIV-1B 全基因序列肽库诱导的CTL 应答反应，分析中国人群HIV-1B 感染者HIV-1 特异性CTL 应答特征，确定免疫优势应答区域。通过对病毒基因和多肽序列进行分析，进一步筛选出具有保守性的免疫优势区域，结合对患者HLA-错误！未找到引用源。基因分型，选择携带中国人群常见等位基因并对该区域应答的患者，结合数据库中已确定的表位，对这些区域中常见等位基因限制的表位进一步确证，从而筛选出可用于研发针对中国人群的HIV-1 疫苗所需表位。 主要研究内容和结果如下： 1．采用多重套式PCR 方法扩增Gag 基因，根据结果确定12 例HIV-1B 感染者。结合以前分型结果，共选择66 例感染者为研究对象，用PCR-SSP（系列特异性引物）技术鉴定HLA-I 型等位基因分型，发现研究人群8 个HLA-错误！未找到引用源。类基因型A*02，A*24，A*11，B*13，Cw*03，Cw*07，Cw*01，Cw*06 分布频率大于10％，与以前的结果一致，基因型B*15，B*40 略低于大规模调查结果，提示本研究人群能较好的代表中国人群。 2．用ELISpot 法检测HIV-1B 感染者覆盖HIV-1B 全基因共享序列肽库诱导的CTL 应答反应，共发现14 个免疫优势区，分布在Gag、Pol、Env、Nef蛋白区，其中6 个位于Gag 区, 1 个位于Pol 区, 3 个位于Env 区，4 个位于Nef 区，与白种人群和非洲人群观察的结果相似，但从每个蛋白的具体肽段分析，则存在明显差异。 3．对部分病毒基因测序，结合Los Alamos 数据库中已公布的中国地区HIV-1B亚型序列对确定的14 个免疫优势区进行分析，除位于Pol 的免疫优势区外，其他免疫优势区基因序列变异程度显著低于相对应全基因序列，氨基酸序列变异程度显著低于相应蛋白氨基酸序列，提示这些免疫优势区具有高度的保守性。 4．在确定的免疫优势区中发现21 个中国人群常见等位基因限制的表位，其中11 个表位(VKVVEEKAF,EKAFSPEV,FSPEVIPMF, SPEVIPMF, VIPMFSAL,TPQDLNTM, EGATPQDL，GQMREPRGSDI,YVDRFYKTL，RDYVDRFFKT, TLRAEQATQD)位于Gag 区,6 个表位（QVPLRPMTYK, WIYHTQGYF，TQGYFPDWQNY，GYFPDWQNY, YFPDWQNYT, NYTPGPGVRY）位于Nef 区；4 个表位（LWVTVYYGV，TVYYGVPVWK，VYYGVPVWKEA，RAIEAQQHL）位于Env 区。由于Nef 区表位诱导的CTL 应答可能是非保护性的，故疫苗设计中应注意删除，而位于Gag 和Env 区的表位诱导的CTL应答可能具有保护作用，可用于构建针对中国人群的HIV疫苗。 综上所述，中国人群HIV-1B 亚型感染者HIV-1 特异性CTL 应答模式与白种人群和非洲人群存在明显不同；本课题中共确定14 个免疫优势区，绝大部分免疫优势区具有高度的保守性，其中共发现21 个中国人群常见等位基因限制的表位，能诱导强大的CTL 应答的保守性表位，对于研发针对中国人群的安全、有效的HIV 疫苗可能具有重要的现实意义。

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