基于解剖学分区的人类胃黏膜蛋白质组学的研究

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目的：绘制人类第一张基于解剖学分区的正常胃粘膜高分辨率蛋白表达谱，建立胃粘膜蛋白表达的数据库；结合数理统计学描绘各个解剖分区的蛋白表达丰度的正常参考值范围，探究各个解剖学分区的功能差异，为胃癌等胃粘膜相关疾病的诊断与治疗的研究奠定了基础。
　　方法：通过引进和建立的sRP技术，联合高通量质谱分析平台，结合实验室开发的一站式蛋白质组学数据分析Firmiana等技术平台，从而建立了一整套完整的从临床样本收集与处理到质谱检测与生物信息学分析的研究方案。胃粘膜按解剖学分为贲门、胃底、小弯、大弯、胃角、胃窦和幽门等7个分区，使用该方案每个分区分别检测了10例样本，共测定了70例胃黏膜组织样本的全蛋白表达谱。
　　采用基于峰面积的无标定量（intensity based absolute quantification，iBAQ）方法来表征蛋白的表达水平，然后再对数据进行归一化处理：鉴定的每个蛋白与鉴定到的所有蛋白的定量比值，去除质谱检测时上样量等因素造成的误差。采用Bootstrap方法估计小样本（n<10）时每个解剖学分区的蛋白表达水平的差异。使用Shapiro-Wilk统计学方法计算胃黏膜数据的分布情况，根据数据的分布情况进一步计算各个解剖分区的蛋白表达丰度的正常参考值范围。
　　差异蛋白（过表达）蛋白（Region enriched proteins，REP）的筛选按照该解剖分区与其他六个分区的数据在统计学上有差异（P＜0.05），符合正态分布的利用 t检验，不符合正态分布的采用 WMW检验计算统计学差异。进一步采用Pearson相关分析，评价各个解剖学分区的差异蛋白在不同分区之间的相关性。
　　结果：基于先进的样本预处理技术与高通量质谱检测方法，组织蛋白的鉴定数目从文献报道的4000左右的水平提高到6000左右，大大提高了胃黏膜蛋白鉴定覆盖的深度；同时将质谱分析一例组织样本质谱分析的时间由3-4d缩短到10h以内，极大地提高了质谱分析的效率。在肽段和基因产物的发现错误率（false discovery rate，FDR）小于1％时，70例胃黏膜组织样本共鉴定到了9875个蛋白，7个解剖学分区都鉴定到的蛋白数目也达到了6375。通过无标定量技术，我们发现微量胃粘膜组织的蛋白质组已经覆盖了108的波动范围。转录因子和蛋白激酶在生物体内的表达量一般都很低，通常要经过富集过程的处理才能鉴定到，但是在本研究中仍然鉴定到了719个转录因子和激酶；如转录因子核糖核苷酸聚合酶I（Upstream Binding Transcription Factor, RNA Polymerase I，UBTF）的表达量只有管家蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase， GAPDH）的1/200，而蛋白激酶磷酸肌醇-3-激酶的调节亚型（Phosphoinositide-3-Kinase, Regulatory Subunit4，PIK3R4）的表达量更少，只有GAPDH的1/1000。综上可知，本研究已经达到了深度覆盖的胃粘膜蛋白质组学分析的水平。
　　本研究与转录组EBI-AE数据库对比，鉴定到了其中65.3%的基因产物（即9167个蛋白），新发现了692个表达蛋白，是对转录组学研究的重要补充，为这些基因的研究提供了蛋白水平上的证据；通过定量水平的相关分析，整体上所有相同基因的蛋白表达水平与转录水平之间的相关系数R2为0.32。在基因水平上，除了Y染色体之外，每条染色体上的基因表达比例均在30%-40%之间，而与解剖学分区并没有明显的关联。
　　采用 Bootstrap方法估计每个解剖分区蛋白表达水平的变异。随着抽样例数的增加，每个解剖分区的变异系数的变异系数逐渐变小且趋于稳定，当抽样例数为8-10时，变异系数的变异系数几乎均在0.7左右，这说明了每个分区测定10例样本时，整体上胃粘膜蛋白的表达水平已经比较稳定，即10例样本就足以代表每个解剖分区的蛋白表达情况。
　　在七个分区中，有些胃粘膜蛋白在各个解剖分区上的表达情况差异很小，而另一些蛋白的表达差异却非常大。如管家蛋白G APD H在7个分区的表达量都很高；而促进胃酸分泌的胃泌素蛋白（Gastrin，GAST）在胃角、胃窦和幽门的表达量明显高于其他四个解剖学分区；而人类表皮生长因子受体2（Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase2，ERBB2）在胃角、胃窦和幽门的表达量较高，但总体表达量远远低于管家蛋白GAPDH和胃泌素蛋白。通过对胃黏膜7个分区全部蛋白的表达情况分析发现，表达的蛋白在整体胃上符合正态分布的数目很少，只有392个蛋白，而在同一个分区内的表达蛋白符合正态分布的数目约为3000左右，提示胃粘膜蛋白在整体胃上表达的差异可能较大，而在同一个分区的差异则相对较小。根据各个区的分布特点，分别计算每个分区蛋白表达丰度的正常参考值范围，符合正态分布的蛋白以平均值和95%的置信区间（μ-1.96σ，μ-1.96σ）表示，不符合正态分布的蛋白则以非零数值的中位数和极值表示（min，max）。
　　在数据整体分布特点的基础上，合理运用t检验和WMW检验等统计学检验方法，结合基因表达上调2倍以上及表达频率筛选各个解剖分区的差异蛋白。结果发现小弯的差异蛋白最少，但却是该分区所特有的；胃窦与幽门部的差异蛋白较多，但相互之间共有的差异蛋白也较多，提示胃窦幽门部的功能可能相对较为复杂或具有一些独特的生物学功能。通过相关性分析发现，贲门、胃底、大弯和小弯之间的相关系数均在0.95以上，胃角、胃窦和幽门之间的相关系数也在0.9左右，但近端胃与远端胃的相关性不高，相关系数都在0.4以下。差异蛋白的GO注释结果发现各个解剖学分区在功能上是存在差异的，尤其是近端胃与远端胃的功能差异更加明显，幽门还较多的参与免疫等生物学过程。同样，转录因子与激酶的KEGG pathway分析也主要提示了近端胃与远端胃在功能上的差异，主要是远端胃参与了相关的免疫过程。
　　结论：采用简单、高效的sRP预分离技术联合高通量质谱检测平台，成功描绘了人类第一张基于解剖学分区的正常胃粘膜高分辨率蛋白表达谱，并建立了胃黏膜的蛋白表达数据库，确定了正常胃粘膜蛋白表达丰度的正常参考值范围；同时发现各个解剖分区的蛋白表达水平存在一定差异，尤其是近端胃与远端胃之间的差异更加明显。为以后胃癌等胃黏膜相关疾病的诊断与治疗的研究奠定了一定的基础。

著录项

作者
杨帅;
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作者单位

解放军军事医学科学院;

中国人民解放军军事医学科学院;

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授予单位解放军军事医学科学院;中国人民解放军军事医学科学院;
学科肿瘤学
授予学位硕士
导师姓名徐建明;
年度 2016
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类胃疾病;生物化学检验、临床检验;
关键词
胃黏膜; 蛋白表达谱; 解剖学分区; 参考值范围; 差异蛋白; 质谱检测;

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