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丙肝病毒核心抗原新型生物条形码检测技术的建立与初步应用

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缩略词表

前言

1丙型肝炎病毒简介

2 HCV检测技术

3生物条形码检测技术

材料和方法

1材料

2条形码DNA荧光定量PCR检测体系的建立

3 GNP探针的制备与鉴定

4 MMP探针的制备与鉴定

5“GNP-HCVcAg-MMP”三明治复合物反应体系的建立

6 HCVcAg新型生物条形码检测技术的评价

7 HCVcAg新型生物条形码检测技术的初步应用

实验结果

1条形码DNA荧光定量PCR检测体系的建立

2 GNP的制备与鉴定结果

3 MMP探针标记HCVcAg单抗的鉴定

4 “GNP-HCVcAg-MMP”三明治复合物的形成优化和检测

5 HCVcAg新型生物条形码检测技术的评价

6 HCVcAg新型生物条形码检测技术的初步应用

讨论

1条形码DNA荧光定量PCR检测体系的优势

2 GNP探针中未标记条形码DNA的去除

3 HCVcAg新型生物条形码检测技术的优点和不足

结论

参考文献

个人简历

发表论文: 新型BCA中基于实时荧光定量PCR的条形码DNA定量方法的建立

致谢

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摘要

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是全球性的公共卫生问题，据统计全球范围内HCV慢性感染的人数约1.7亿，每年新增HCV感染者300-400万，约80％的感染者会发展为慢性肝炎，10~20%的感染者会进展为肝硬化肝癌。HCV属黄病毒科肝病毒属的单股正链RNA病毒，基因组全长9.6kb，可编码出1个约3010个氨基酸的多聚蛋白前体，经过剪接后形成功能性的结构蛋白和非结构蛋白。HCV核心蛋白位于多聚蛋白前体的N端，与其他蛋白相比，在不同HCV基因型间核心蛋白的氨基酸序列十分保守，且在HCV感染的早期就会出现在血液中，现已成为检测HCV感染的一项重要指标。
　　精准的检测手段对于控制HCV传播和临床治疗十分重要，目前HCV感染诊断多依据血清中检出抗-HCV抗体，但抗-HCV抗体检测无法区分活跃感染期和感染恢复期，且其检测的“窗口期”较长（45~68天）。HCV-RNA检测为目前HCV感染的确诊手段，灵敏度较高，但易受免疫应答反应的干扰，无法完全取代免疫学检测的优势。HCV核心抗原（HCV core antigen，HCVcAg）检测虽无“窗口期”的限制，且已有检测试剂盒上市，但检测原理多基于酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA），无法满足低浓度样本的检测要求，所以探索超灵敏的HCVcAg免疫学检测方法十分必要。
　　2003年，Mirkin首次报道了生物条形码检测技术（bio-barcode assay，BCA），它巧妙地将病原蛋白的检测转化为核酸检测，其突出特点是具有极高的检测灵敏度。本研究在BCA技术的基础上，优化金纳米探针（gold nanoparticles probes，GNP）和三明治复合物检测步骤，将其与基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR（fluorescence-based quantitative real-time PCR，qPCR）相结合，建立了HCVcAg新型BCA检测技术。研究主要包括以下4部分：
　　1.条形码DNA的设计及其参考品的制备
　　在GenBank中选择一段与HCV同源关系较远的植物基因为蓝本，设计并合成了针对HCVcAg新型BCA检测的条形码DNA序列及其引物和TaqMan探针序列，并对其长度进行优化。优化后的条形码DNA经过PCR扩增后，将扩增产物连接到pMD-18T载体上，转入E.coli DH5α感受态细胞。经Amp+抗性筛选和菌落PCR鉴定出阳性菌落，然后用Amp+液体培养基增殖阳性菌落，提取重组质粒，进行酶切、测序鉴定。优化条形码DNA qPCR检测体系的重要反应参数，然后以一系列梯度稀释的条形码DNA参考品质粒为模板，建立qPCR标准曲线，并对建立的条形码DNA qPCR定量方法进行敏感性评价。
　　2.GNP探针、MMP探针的合成和鉴定
　　鉴定出活性较好、无交叉反应的HCVcAg多克隆抗体和单克隆抗体组合，并在此基础上构建HCVcAg双抗体夹心ELISA检测体系，体系的检测灵敏度可达2ng/mL。
　　将HCVcAg多克隆抗体包被到金纳米颗粒上，并对多抗包被量进行优化，然后把巯基标记的条形码DNA包被到“金纳米颗粒-HCVcAg多抗”复合物上。用DNase I处理标记后的金纳米复合物，并优化处理时间，尽可能地去除未标记的条形码DNA，减少GNP探针表面条形码DNA的损耗。分别用透射电子显微镜（transmission electron microscope， TEM）、紫外-可见分光光度测定法（ultraviolet-visible spectrophotometry，UV-vis）、斑点ELISA和qPCR检测体系对GNP探针表面包被的HCVcAg多抗和条形码DNA进行鉴定，得到的GNP探针浓度为1.22×10-9M。将HCVcAg单克隆抗体包被到磺酰基修饰的磁性微球上，制成磁性微球探针（magnetic microparticles，MMP），鉴定包被效率为75.6%，斑点ELISA鉴定包被的抗体显示出良好的活性。
　　3.HCVcAg新型BCA检测体系的优化和评价
　　首先验证一定体积范围内，MMP探针对条形码DNA的qPCR检测体系无明显影响，然后优化新型BCA检测体系中GNP探针和MMP探针的反应比例。基于优化的结果，将2个探针与HCVcAg反应形成“GNP-HCVcAg-MMP”三明治复合物，不释放三明治复合物中的条形码DNA，直接用qPCR检测体系检测三明治复合物。分别对新型BCA检测体系的灵敏度、特异性和重复性进行方法学评价，评价结果：新型BCA检测体系检测重组HCVcAg的灵敏度达到1fg/mL，约为常规ELISA法的106倍；对114份不同来源的抗-HCV抗体阴性血清样本进行测定，特异性达到98.2%；批间和批内的变异系数（coefficient of variation，CV）均小于5%，重复性良好。
　　4.HCVcAg新型BCA检测体系的初步应用
　　利用商品化HCVcAg和HCV-RNA检测试剂盒对已知抗-HCV抗体阳性的血清样本进行检测，然后再用HCVcAg新型BCA检测体系检测，结果新型BCA技术的检出率低于商品化 HCVcAg试剂盒。结合新型 BCA检测的特异性评价结果，显示建立的新型 BCA检测体系适用于未产生抗-HCV抗体前的血液样本的测定。
　　综上所述，本研究初步建立了HCVcAg新型BCA检测体系，并对体系进行了方法学评价和初步应用。该检测体系虽然在血清样本的检测方面仍需改进，但为血液中HCVcAg超灵敏检测奠定了基础，对推动血液病毒蛋白检测的研究发展以及保障血液安全具有重大意义。

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