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泰国伯克霍尔德氏菌中烷基过氧化物酶(AhpC)抗环境胁迫作用机制研究

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第一章 文献综述

1.1 泰国伯克霍尔德氏菌简介

1.2 细菌抗氧化机制研究

1.2.1 活性氧(ROS)

1.2.2 氧化应激调控因子

1.3细菌自由基清除机制

1.3.1 活性氧自由基

1.3.2 抗氧化酶系与小分子抗氧化剂

1.4 研究目的与意义

1.5 技术路线

第二章 材料与方法

2.1 菌株质粒和引物

2.2 试剂

2.2.1 培养基

2.2.2 分子生物学试剂

2.2.3 生化试剂

2.3 实验方法

2.3.1 质粒提取

2.3.2 克隆构建

2.3.3 DNA片段回收

2.3.4 DNA片段酶切及连接

2.3.5 热激感受态的制备及化学转化

2.3.6 构建突变体及回复株

2.3.7 细胞总RNA提取

2.3.8 凝胶阻滞迁移实验(EMSA)

2.3.9 胞内ROS检测

2.3.10 不同胁迫条件下存活率实验

2.3.11 蛋白的表达与纯化

2.3.12 催化动力学测定

2.3.13 亚硫酸和二硫键生成分析

2.3.14 亚磺酸与二硫键的分析

第三章 实验结果

3.1 OxyR对伯克霍尔德氏ahpC的调控作用

3.1.1 OxyR负调控ahpC的表达

3.1.2 OxyR直接调控ahpC

3.2 AhpC在氧胁迫条件下的作用

3.3 AhpD作为AhpC的电子供体

3.4 Cys57和Cys171、Cys173分别为过氧化半胱氨酸残基(CP)和再生Cys残基(CR)

3.5 AhpC点突变体酶活性测定

第四章 分析与讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

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摘要

生物体在外界不利环境刺激下,将会产生氧化应激反应,即通过活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)引起胞内大分子物质的氧化,从而打破胞内氧化还原平衡,造成细胞功能紊乱,导致细胞损伤乃至凋亡。为应对这些氧化损伤,生物体进化出对一系列抗氧防御机制,其主要包括两种:抗氧化物酶系统、小分子抗氧化剂(Low molecular massantioxidant,LMMA),其中小分子抗氧化剂主要以硫醇为主,包括分枝硫醇(Mycothiol,MSH)、半胱氨酸(Cys)、维生素C、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)等。本研究中,以泰国伯克霍尔德氏菌(Burkholderia thailandensis)为研究对象,研究该菌中烷基过氧化物酶(Alkylhydroperoxide reductase subunit C,AhpC)在氧化胁迫过程中的作用以及其抵抗环境胁迫的外在生理表型下的内在作用机制,主要研究结果如下: 1. 转录组数据和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析表明,ROS能够诱导AhpC表达,OxyR蛋白对AhpC表达有负调控作用。凝胶迁移阻滞试验(EMSA)表明,OxyR能直接且特异地结合到ahpC启动子区域,调节其转录水平。 2. 构建了AhpC突变体和回补AhpC的互补菌株,测定了这些菌株在不同氧化剂、烷化剂和亚硝酸盐等胁迫剂处理下的存活率。结果表明,AhpC能明显增强Burkholderia thailandensis的抗环境胁迫能力,揭示了AhpC在泰国伯克霍尔德氏菌中的生理功能。 3. 在不同胁迫剂处理下测定AhpC的酶活,结果表明AhpC对各种底物表现出不同的亲和力,提示在H2O2、过氧化氢叔丁基(t-BOOH)、过氧化物异丙苯(CHP)和过氧亚硝酸盐处理下AhpD可以作为AhpC的电子供体。 4. 通过氨基酸序列比对发现Cys57是保守的过氧化半胱氨酸残基(CP),其在不同细菌的ahpC基因中高度保守,进一步研究表明Cys57为过氧化半胱氨酸残基(CP), Cys171和Cys173为再生Cys残基(CR)。 5. 分别将AhpC中Cys57、Cys171和Cys173突变(Cys到Ser,即AhpC:C57S, AhpC:C171S和AhpC:C173S),并构建了AhpC:C171S C173S双突变体,之后对其酶活性质进行检测。结果表明,AhpC 的这三个残基在暴露于不同种类的氧化应激时发挥不同抗氧化作用。 综上所述,本研究发现泰国伯克霍尔德氏菌中的AhpC具有抗环境胁迫的生理功能,其生理功能的内在机制是通过直接或间接消除过量的 ROS 来提高细胞内抗氧化酶的活性和表达水平,以增加细胞内蛋白可逆巯基化修饰等方式来实现。

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