猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究

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猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属病毒，是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，临床表现为初孕母猪不孕、流产、产木乃伊胎和死胎等现象。PPV在全球大部分地区呈地方性流行，在未接种疫苗或疫苗接种不当的猪群中可造成毁灭性的流产风暴。大量研究报道，PPV感染可引起胎儿或仔猪的多种组织脏器发生损伤进而引起胎儿死亡或产弱仔等，并以此解释 PPV 诱导繁殖障碍的原因，但是，关于 PPV 感染对妊娠母体的影响却鲜有报道。卵巢黄体是建立和维持妊娠的重要组织，主要通过黄体细胞合成孕酮以维持正常的妊娠。已有研究报道，PPV感染可导致母体黄体组织受损，进而引起不孕和流产等病理现象的发生，但其具体作用分子机制尚不清楚。本研究首先建立永生化黄体细胞系，为后续研究提供可靠的细胞模型。然后用PPV分别感染原代和永生化猪黄体细胞，检测PPV感染诱导黄体细胞凋亡和凋亡信号转导通路，明确 PPV 感染抑制黄体细胞孕酮产生及相应机制。最后，PPV感染初孕母猪，从体内水平进一步验证 PPV 感染诱导黄体细胞凋亡的信号转导通路和抑制孕酮产生的机制。旨在从体外和体内水平探讨 PPV 感染诱导猪黄体细胞凋亡和对孕酮产生的影响，并解析其相关分子作用机制。研究取得以下结果。 1 取妊娠30~50 d健康母猪的黄体组织，胶原酶消化法和密度梯度离心法对原代黄体细胞进行分离、纯化和培养。转染pCI-neo-hTERT质粒并用100μg/mL G418连续筛选获得单克隆细胞，对获得的单克隆细胞进行扩大培养和类固醇合成功能的检测，最终确定一株可连续传代 50 次且未发生衰老迹象并保存类固醇激素合成能力的细胞系，命名为hTERT-PLCs。RT-PCR和端粒酶检测结果显示，hTERT-PLCs中hTERT能够稳定表达且维持较高的端粒酶活性。核型分析结果显示，转染后30和50代的黄体细胞染色体均保持正常的二倍体结构形式。3β-HSD 活性染色和 Oil-Red-O 染色结果显示，与原代猪黄体细胞一致，hTERT-PLCs两种染色结果均呈阳性。透射电子显微镜观察结果显示，与原代猪黄体细胞超微结构一致，hTERT-PLCs 的细胞间存在间隙连接，且其细胞质中都含有大量的线粒体和滑面内质网。RT-PCR检测结果显示，hTERT-PLCs稳定表达参与孕酮合成和降解过程中关键蛋白和酶的基因（STAR、HSD3B1、CYP11A1和AKR1C1），以及参与调控黄体细胞类固醇激素合成的一些特征性受体的基因（LHCGR、PGR、PRLR、ESR1和ESR2）。促黄体素（Luteinizing hormone，LH）和PGF2α（Prostaglandin F2α）类似物处理原代和永生化黄体细胞，结果显示LH处理后两种细胞中P450scc蛋白表达未发生显著变化（p>0.05），而StAR和3β-HSD蛋白的表达显著增加（p?0.05）；同时，黄体细胞的孕酮产量均显著升高（p?0.05）；PGF2α 类似物处理原代和永生化黄体细胞后StAR和3β-HSD蛋白表达则显著下降（p?0.05），但P450scc蛋白表达未发生显著变化（p>0.05），原代和永生化黄体细胞的孕酮产量均显著下降（p?0.05）。软琼脂和裸鼠致瘤试验结果显示，永生化黄体细胞在体内和体外均未发生恶性转化。 2 MTT结果显示，PPV感染可显著抑制原代和永生化猪黄体细胞的细胞活性（p?0.05）。qPCR检测发现PPV可在原代和永生化黄体细胞中进行DNA复制，且随感染时间延长细胞中病毒拷贝数显著增多（p?0.05）。Hoechst染色结果显示PPV感染可诱导黄体细胞出现核固缩和核碎裂。DNA 片段化分析结果显示，PPV 感染一定时间后可引起黄体细胞出现DNA Ladder现象。流式细胞术检测结果显示，AnnexinV阳性细胞比率随PPV感染时间延长显著上升（p?0.05）。Caspase活性检测和流式细胞凋亡率检测结合caspase特异性抑制剂检测，结果显示，PPV感染使caspase-9和caspase-3的活性显著升高（p?0.05）；而caspase-8 活性未发生显著变化（p>0.05），且 caspase-8特异性抑制剂预处理也未对caspase-3活性造成显著影响（p>0.05）。同时，Western blotting检测结果显示，PPV感染过程中原代和永生化黄体细胞中Fas和FasL蛋白表达均未发生显著变化（p>0.05）；而Bax蛋白表达显著上升（p?0.05），且细胞质中Bax蛋白量显著下降（p?0.05），线粒体中 Bax 蛋白量则显著上升（p?0.05），Bcl-2 蛋白表达显著下降（p?0.05），进而导致Bax/Bcl-2比率显著上升（p?0.05）。线粒体中cyt c蛋白水平显著下降（p?0.05），细胞质中cytc显著升高（p?0.05）。Western blotting和RT-PCR法检测p53蛋白及基因表达的变化情况，结果显示，PPV感染可诱导原代和永生化黄体细中p53蛋白含量显著升高（p?0.05）且p53 mRNA表达水平也显著上升（p?0.05）；同时，p53特异性抑制剂和p53 siRNA可显著抑制PPV诱导的Bax蛋白的表达（p?0.05）、caspase-3活性的升高（p?0.05）和黄体细胞凋亡率的上升（p?0.05）。Western blotting检测结果显示，PPV感染可引起原代和永生化黄体细胞中p38 MAPK磷酸化水平显著升高（p?0.05）。p38特异性抑制剂预处理原代和永生化黄体细胞，Western blotting结果显示p38特异性可显著抑制PPV诱导的p53蛋白含量的升高（p?0.05）并使细胞核中p53蛋白水平显著下降（p?0.05）；流式细胞术检测结果显示，p38 特异性抑制剂预处理可显著抑制 PPV诱导的黄体细胞凋亡率的升高（p?0.05）。 3 PPV感染原代和永生化黄体细胞，放射免疫法检测上清中孕酮含量结果显示，PPV感染显著降低细胞上清中孕酮含量（p?0.05）。Western blotting和Real-timePCR法检测PPV感染后黄体细胞中调控孕酮合成的关键蛋白StAR和关键酶3β-HSD和P450scc的表达变化，结果显示，PPV感染可显著抑制StAR、3β-HSD及P450scc mRNA和蛋白的表达（p?0.05）。此外，Bax特异性抑制剂预处理原代和永生化黄体后，采用放射免疫法检测上清中孕酮含量结果显示，Bax特异性抑制剂可显著抑制PPV诱导的孕酮水平的下降（p?0.05）。同时，放射免疫检测结果显示 p53 特异性抑制和 p38 特异性抑制剂剂预处理均能显著抑制PPV诱导的孕酮产量的下降（p?0.05）。 4 将36头健康初孕母猪，随机分为对照组和PPV感染组，18头/组。在配种前、配种后第22天（通过滴鼻感染PPV，记为0 dp.i.），7dp.i.、14 dp.i.、21 dp.i.、28 dp.i.和35 dp.i.采集血液，制备血清。一份用于检测血清中PPV抗体水平，发现PPV感染后，血清中 PPV 抗体水平变为阳性。另一份采用放射免疫法检测血清中孕酮含量，结果显示，PPV感染14 dp.i.妊娠猪血清中孕酮含量发生显著下降（p?0.05）。在感染21 dp.i.、28 dp.i.和35 dp.i.处死对照组和PPV感染组初孕母猪，采集卵巢组织进行原位杂交染色，结果显示在黄体组织中，PPV主要的黄体细胞内进行复制，且随感染时间的延长，黄体组织中病毒量逐渐增多。TUNEL和间接免疫荧光染色结果显示，随着PPV感染时间延长黄体组织中发生凋亡的细胞数量显著上升，且发生凋亡的细胞主要为黄体细胞。HE染色结果显示，与对照组相比，PPV感染组的黄体细胞出现明显的固缩和空泡化现象，并随感染时间的延长病变愈加明显。透射电子显微镜观察PPV感染35 dp.i.黄体组织中黄体细胞超微结构变化发现，PPV感染可引起黄体细胞出现细胞核固缩、胞质体积减小、细胞器溶解和凋亡小体等凋亡现象。Western blotting检测发现，PPV感染可使黄体组织中活化的 caspase-9和caspase-3 表达显著升高（p?0.05）；并显著上调促凋亡蛋白 Bax的表达（p?0.05），抑制抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达（p?0.05）。同样，p53 蛋白和磷酸化p38 MAPK在黄体组织中蛋白水平均显著升高（p?0.05）。提取黄体组织的总RNA和蛋白通过Real-time PCR和Western blotting法检测孕酮合成过程中关键蛋白（StAR）和关键酶（3β-HSD和P450scc）mRNA和蛋白表达水平的变化情况，结果显示，随着 PPV感染时间的延长，黄体组织中StAR、3β-HSD和P450scc mRNA和蛋白表达水平均显著下降（p?0.05）。本研究获得了一株具有遗传稳定性、并保留了原代猪黄体细胞主要生物学特性和功能的永生化猪黄体细胞系。PPV感染原代和永生化猪黄体细胞，qPCR法检测发现，PPV可以在黄体细胞中复制，Hoechst 33258染色、DNA片段化分析、流式细胞术检测发现， PPV感染诱导了黄体细胞发生凋亡。进一步探讨PPV感染诱导黄体细胞凋亡机制发现， PPV感染是通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞发生凋亡。PPV感染原代和永生化猪黄体细胞，检测孕酮合成过程中关键蛋白 StAR 及关键酶 3β-HSD和P450scc的表达发现，PPV感染通过抑制关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和P450scc的表达抑制黄体细胞孕酮合成。分别使用PPV诱导黄体细胞凋亡关键蛋白Bax、p53和p38的特异性抑制剂预处理黄体细胞发现黄体细胞孕酮产量有所升高。PPV人工感染初孕母猪发现，黄体组织TUNEL染色阳性细胞主要为黄体细胞，并进一步证实了PPV在体内感染条件下，也是通过激活 p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。人工感染初孕母猪过程中，机体血清中孕酮水平显著下降，StAR、3β-HSD和P450scc的表达也发生显著下调，与体外细胞试验结果一致。研究结果证实了 PPV 感染可诱导黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生，揭示了 PPV 诱导猪黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生的机制，为进一步研究PPV的致病机理提供依据。

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作者
张樑;
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作者单位

西北农林科技大学;

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授予单位西北农林科技大学;
学科基础兽医学
授予学位博士
导师姓名童德文;
年度 2018
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正文语种中文
中图分类药理学;药物基础科学;
关键词
病毒诱导; 黄体细胞凋亡; 抑制; 孕酮;

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