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罗尔斯通氏菌中Reut_A2805蛋白调节Ⅵ型分泌系统抗氧化功能的研究

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摘要

第一章 文献综述

1．1．3 Ⅵ型分泌系统的功能

1．1．4 Ⅵ型分泌系统的表达调控

1．2 细菌抗氧化研究

1．3 罗尔斯通氏菌T6SS研究

1．3．1 罗尔斯通氏菌

1．3．2 罗尔斯通氏菌T6SS研究现状

1．4 研究的目的意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 菌株和质粒

2．1．2 化学试剂和主要培养基

2．1．3 主要仪器

2．1．4 引物

2．2 实验方法

2．2．1 克隆的构建

2．2．2 制备感受态细胞

2．2．3 重组蛋白的表达与纯化

2．2．4 基因敲除

2．2．5 构建T6SS1报告基因融合质粒以及启动子β-gal酶活的测定

2．2．6 蛋白质印迹(Western Blot)

2．2．7 凝胶迁移实验(EMSA)

2．2．8 RT-PCR

2．2．9 抗环境胁迫检测

2．2．10 活性氧自由基(ROS)检测

第三章 实验结果

3．1 Cupriavidus necator JMP134具有抗氧胁迫能力

3．2 Reut_A2805蛋白响应氧化胁迫

3．3 Reut_A2805直接与T6SS1启动子结合

3．4 Cupriavidus necator JMP134中T6SS1的表达受Reut_A2805正调控

第四章 分析与讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

作者简介

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摘要

细菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)广泛存在于革兰氏阴性菌中，是近年来发现的具有多种功能的新型分泌系统。目前研究发现T6SS参与了致病菌侵染宿主，生物膜的形成，细菌间的相互作用，抗环境胁迫反应及群体感应等一系列生命活动，因此，T6SS复杂的功能可帮助细菌适应多变的生存环境。罗尔斯通氏菌(Cupriavidus necator JMP134)作为环境友好型微生物，最初对于它的研究仅限于苯代污染物的降解和PHB的合成。经过基因组比对分析，发现在Cupriavidus necator JMP134中存在着两套T6SS，到目前为止尚没有关于Cupriavidus necator JMP134中T6SS相关功能的报道。本实验以Cupriavidus necator JMP134中第一套Ⅵ型分泌系统(T6SS1)为研究对象，对其功能及其调控进行了研究。具体的研究成果如下:
　　1.构建了Cupriavidus necator JMP134中T6SS1核心保守基因clpV(reut_A1727)缺陷突变株。通过比较野生型和突变体之间在盐、酸、氧化剂等多种胁迫下的存活率的差异，发现在氧化剂胁迫下野生株的存活率明显高于突变株，说明该套分泌系统与抗氧化功能相关。
　　2.通过蛋白质序列比对，找到了Cupriavidus necator JMP134中oxyR的同源基因reut_A2805，构建了此基因的突变株，比较在氧化胁迫下突变株与野生株之间的存活率差异，发现野生株存活率显著高于突变株，推测此基因可能参与了对T6SS1的调控。
　　3.对T6SS1启动子分析，发现了Reut_A2805蛋白可能的结合位点，EMSA实验表明Cupriavidus necator JMP134中Reut_A2805蛋白可直接结合在T6SS1启动子上。通过启动子酶活检测、RT-PCR以及Hcp1的分泌检测等实验研究Reut_A2805对T6SS1的调控作用，研究结果显示Reut_A2805正调控T6SS1。
　　综上所述，本研究通过对Cupriavidus necator JMP134菌株T6SS1的抗氧化胁迫功能的研究，认为Cupriavidus necator JMP134在受到氧化胁迫时，T6SS1的调节因子Reut A2805蛋白可结合在T6SS1启动子上，上调T6SS1的表达，从而减少自身受到的氧化损伤。

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